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影響ELISA實(shí)驗(yàn)的因素和對策

閱讀次數(shù):1390   發(fā)布時(shí)間:2012/11/12 17:42:38

 影響ELISA實(shí)驗(yàn)的因素和對策

ELISA試驗(yàn)以靈敏度較高、特異性較好的特點(diǎn)在科研上得到了廣泛的應(yīng)用,但操作中的各個(gè)環(huán)節(jié)對試驗(yàn)的檢測效果影響較大,如不注意,有可能導(dǎo)致顯色不全、花板等結(jié)果。  

下面將操作中各個(gè)環(huán)節(jié)常出現(xiàn)問題的原因及解決辦法總結(jié)于下:  

選擇試劑:  
選擇質(zhì)量優(yōu)良的檢測試劑,嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行操作,操作前將試劑在室溫下平衡30-60分鐘。  
參考準(zhǔn)備ELISA實(shí)驗(yàn)的正確步驟#ELISA實(shí)驗(yàn)的事前準(zhǔn)備工作一  
標(biāo)本收集與保存:  
避免使用肉眼可見的溶血標(biāo)本、高脂標(biāo)本和混濁標(biāo)本;  
2-8℃下,標(biāo)本可放置24-48小時(shí),長期保存需放置-20℃下。  
請避免反復(fù)凍融。  
具體請參照:  
ELISA實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的采集與處理:  
ELISA實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的保存:  
試劑使用中的準(zhǔn)備工作及注意事項(xiàng):  
試劑盒中會(huì)有提示,一般需要準(zhǔn)備的有:  
洗滌液;用前配制;有的試劑盒會(huì)標(biāo)明,配好的4度下一般可以放一個(gè)月;如果沒有標(biāo)明,盡量用新鮮的,不要多配制。  
顯色液(有A液和B液的),用前15分鐘配制;  
標(biāo)準(zhǔn)品:有的試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品是已經(jīng)配制好的,4度保存;有的是要現(xiàn)配制的;按照說明書操作;  
濃縮生物素結(jié)合的二抗和HRP:如果需要配制,試劑盒沒注明配好可以保存多久的話,盡量現(xiàn)配現(xiàn)用(用前15分鐘配制);  
原則是:  
試劑盒上沒有指出配制物的儲(chǔ)藏方式的話,應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用;不要怕麻煩;  
還有,小瓶的管子開蓋前要離心,以免蓋子上粘連以後總量不夠。  
加 樣: 
室溫溫育的試劑,特別是溫育時(shí)間比較短的實(shí)驗(yàn)操作的試劑,加樣對數(shù)據(jù)的影響比較大。特別要注意加樣問題。  
不好的操作原因:  
不會(huì)正確使用加樣器;  
血清或血漿標(biāo)本分離不好即進(jìn)行加樣;  
手工操作中,加樣板過多造成加樣後放入孵箱前等待時(shí)間過長(特別是室內(nèi)溫度較高時(shí));  
加完標(biāo)本再加酶試劑時(shí)酶濺出孔外; 
解決辦法:  
熟悉加樣器的使用,在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前用水來練習(xí)加樣的快速和準(zhǔn)確;  
試驗(yàn)前標(biāo)本需緩慢升溫至室溫,若標(biāo)本為血清,凍結(jié)血清融解後,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均,應(yīng)充分混勻并避免產(chǎn)生氣泡�;鞚峄蛴谐恋淼难鍢�(biāo)本應(yīng)先離心或過濾,澄清後再檢測;  
加樣時(shí)應(yīng)將所加物加在ELISA 板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注意不可濺出;  
加樣後及時(shí)放入孵箱;  
加酶試劑後用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干;  
如果采用AT或其他全自動(dòng)加樣,選擇FAME或其他後處理儀器加酶試劑;  
標(biāo)本較多時(shí),請分批操作。每次加樣在兩到三分鐘內(nèi)完成。加標(biāo)本時(shí)三排一加。每次加完樣進(jìn)行計(jì)時(shí);

參考ELISA#加樣  
溫 育:  
不好的操作原因:  
溫育時(shí)未貼封片或加蓋,使標(biāo)本或稀釋液蒸發(fā),吸附于孔壁,難于清洗徹底;  
溫育時(shí)間人為延長,導(dǎo)致非特異性結(jié)合緊附于反應(yīng)孔周圍,難以清洗徹底。  
解決辦法:  
貼封片或加蓋:為避免蒸發(fā),板上應(yīng)加蓋,也可用塑料貼封紙或保鮮膜復(fù)蓋板孔,反應(yīng)板不宜疊放,以保證各板的溫度都能迅速平衡。  
按說明步驟嚴(yán)格控制操作時(shí)間。  
建議采用空氣浴進(jìn)行溫育。  
參考ELISA實(shí)驗(yàn)操作中的溫育(incubation)  
洗 板:  
結(jié)果不好的可能原因  
采用手工洗板,孔與孔之間液體交叉。  
采用半自動(dòng)洗板機(jī)洗板時(shí),洗液量不足,導(dǎo)致洗板不徹底;洗板針堵塞,抽吸不完全;洗板不暢,導(dǎo)致洗板效果差。  
反應(yīng)板過多造成洗板等待時(shí)間長。  
在間接法中如本底較高。 


在ELISA 操作中,洗滌是*主要的關(guān)鍵技術(shù),操作時(shí)尤為注意:  
保證洗液注滿各孔,洗板針暢通,洗完板後在吸水紙或毛巾(選擇干凈、無或少塵的吸水材料)上輕輕拍干(若使用易掉渣的紙,紙屑會(huì)留在板孔中,由于紙屑中含有氧化劑而造成高值陰性。);  
注意各種試劑盒的洗液不要混用。如果洗液需要稀釋,應(yīng)按要求稀釋,所用的水電導(dǎo)率在1.5us/cm 之下,洗液如果結(jié)晶應(yīng)待其融解後配制。  
保證洗板浸泡時(shí)間為40 秒左右,孔內(nèi)液體被洗板機(jī)吸收得越干凈洗滌效果更好,手工洗板防止洗液在孔內(nèi)形成氣泡。  
合理安排,或多用幾臺(tái)洗板機(jī)。  
在間接法中如本底較高,可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時(shí)間。  
參考ELISA#洗滌  
顯 色:  
結(jié)果不好的可能原因  
顯色劑配制後放置時(shí)間過長或使用過期顯色劑;  
加顯色劑時(shí)濺出孔外造成液體回流。  
解決方法:  
顯色劑盡量在臨用前配制,堅(jiān)持不用過期顯色劑,肉眼可見淺藍(lán)色的TMB顯色劑不用;  
加樣時(shí)保持顯色劑不外流,且加樣量要準(zhǔn)確,順序不能顛倒。  
A、B液應(yīng)避免接觸金屬器械。  
可以參考ELISA#顯色和比色  
終 止:  
結(jié)果不好的可能原因:  
加終止液時(shí)產(chǎn)生較多氣泡,導(dǎo)致假陽性增加。 


解決方法:  
加終止液時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡,及時(shí)終止顯色。  
讀 板:  
結(jié)果不好的可能原因:  
讀板時(shí)板底底部不透明、帶水滴、有劃痕及不規(guī)則的表面。  
應(yīng)保證酶標(biāo)板清潔。  
此外酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強(qiáng)光照射下,操作時(shí)室溫宜在15~30℃,使用前先預(yù)熱儀器15-30 分鐘,測讀結(jié)果更穩(wěn)定。  
全過程:  
整個(gè)操作過程中保證酶標(biāo)板不接觸次氯酸;  
實(shí)現(xiàn)ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化,有效提高檢測質(zhì)量。 

嚴(yán)謹(jǐn)?shù)脑O(shè)計(jì),優(yōu)質(zhì)的試劑,正確的操作和良好的儀器是保證ELISA必要條件。在實(shí)際操作中必須嚴(yán)格遵照規(guī)定操作,以嚴(yán)謹(jǐn)?shù)淖黠L(fēng)檢測每一份標(biāo)本,才能保證試驗(yàn)效果。

人白介素6 ELISA試劑盒上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司現(xiàn)貨供應(yīng),免費(fèi)代測,產(chǎn)品上架一個(gè)星期內(nèi),參與促銷活動(dòng)�?梢詤f(xié)助實(shí)驗(yàn)和委托實(shí)驗(yàn),技術(shù)人員全程指導(dǎo)。我們會(huì)在您交付標(biāo)本的一個(gè)星期內(nèi)出結(jié)果,將實(shí)驗(yàn)過程和結(jié)果快遞到您手中!我公司試劑盒產(chǎn)品在保證質(zhì)量和價(jià)格方面都有絕對優(yōu)勢,產(chǎn)品售前、售中、售后都有專人服務(wù),請您放心購買!特價(jià)促銷活動(dòng)進(jìn)行中··············大家快來搶購吧!訂購熱線:021-60517348。

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