蛋白質(zhì)與多肽激素的放射免疫分析

節(jié)　概述

　　1960年，美國(guó)學(xué)者Yalow 和Berson 創(chuàng)立了放射免疫分析（Radioimmunoassay，RIA），并首先用于糖尿病人血漿中胰島素含量的測(cè)定。這是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域中方法學(xué)的一項(xiàng)重大突破，開(kāi)辟了醫(yī)學(xué)檢測(cè)史上的一個(gè)新紀(jì)元。它使得那些原先認(rèn)為是無(wú)法測(cè)定的極微量而又具有重要生物學(xué)意義的物質(zhì)得以精確定量，從而為進(jìn)一步揭開(kāi)生命奧秘打開(kāi)了一條新的道路，使人們有可能在分子水平上重新認(rèn)識(shí)某些生命現(xiàn)象的生化生理基礎(chǔ)。其后30年中，內(nèi)分泌科學(xué)的飛速進(jìn)展，充分證明了這一超微量分析技術(shù)的巨大推動(dòng)力。1977年，這項(xiàng)技術(shù)的發(fā)明者榮獲諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。隨后這一嶄新的技術(shù)迅速滲透到醫(yī)學(xué)科學(xué)的其它領(lǐng)域，如病毒學(xué)、藥理學(xué)、血液學(xué)、免疫學(xué)、法醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)等，以及與醫(yī)學(xué)生物學(xué)相關(guān)的學(xué)科，如農(nóng)業(yè)科學(xué)、生態(tài)學(xué)及環(huán)境科學(xué)等。放射免疫分析的物質(zhì)，由激素?cái)U(kuò)大到幾乎一切生物活性物質(zhì)。我們放射免疫分析研究起步于1962年，并迅速發(fā)展與普及，對(duì)我國(guó)生物醫(yī)學(xué)的進(jìn)展起著很大的促進(jìn)作用。

　　一、放射免疫分析的優(yōu)缺點(diǎn)

　�。ㄒ唬㏑IA的優(yōu)點(diǎn)

　　放射免疫分析具有許多其它分析方法無(wú)可比擬的優(yōu)點(diǎn)。它既具有免疫反應(yīng)的高特異性，又具有放射性測(cè)量的高靈敏度，因此能精確測(cè)定各種具有免疫活性的極微量的物質(zhì)。

　　1．靈敏度高一般化學(xué)分析法的檢出極限為10^-3～10^-6g,而RIA通常為10^-9（毫微克，ng）、10^-12g（微微克,pg），甚至10^-15g（毫微微克，fg）、10^-18g（微微微克，ag）。

　　2．特異性強(qiáng)由于抗原—抗體免疫反應(yīng)專(zhuān)一性強(qiáng)，所被測(cè)物一定是相應(yīng)的抗原。良好的特異性抗體，能識(shí)別化學(xué)結(jié)構(gòu)上非常相似的物質(zhì)，甚至能識(shí)別立體異構(gòu)體。

　　3．應(yīng)用范圍廣據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前至少已有300多種生物活性物質(zhì)已建立了RIA。它幾乎能應(yīng)用于所有激素的分析（包括多肽類(lèi)和固醇類(lèi)激素），還能用于各種蛋白質(zhì)、腫瘤抗原、病毒抗原、細(xì)菌抗原、寄生蟲(chóng)抗原以及一些小分子物質(zhì)（如環(huán)型核苷酸等）和藥物（如地高辛、毛地黃甙等）的分析，應(yīng)用范圍還在不斷擴(kuò)展。近年來(lái)由于小分子半抗原制備抗體的技術(shù)有很大的發(fā)展，有人預(yù)測(cè)幾乎所有的生物活性物質(zhì)，只要其含量不低于RIA的探測(cè)極限，都可建立適當(dāng)?shù)腞IA法。

　　4．操作簡(jiǎn)便RIA所需試劑品種不多，可制成配套試劑盒；加樣程序簡(jiǎn)單一次能分析大量標(biāo)本，標(biāo)本用量也少；反應(yīng)時(shí)間不長(zhǎng)；測(cè)量和數(shù)據(jù)處理易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；RIA屬體外分析技術(shù)，對(duì)患者無(wú)任何輻射危害。

　�。ǘ�）RIA的缺點(diǎn)

　　1．只能以免疫反應(yīng)測(cè)得具有免疫活性的物質(zhì)，對(duì)具有生物活性百失去免疫活性的物質(zhì)是測(cè)不出的。因此RIA結(jié)果與生物測(cè)定結(jié)果可能不一致。

　　2．由于使用了生物試劑，其穩(wěn)定性受多種因素影響，需要有一整套質(zhì)量控制措施來(lái)確保結(jié)果的可靠性。

　　3．靈敏度受方法本身工作原理的限制，對(duì)體內(nèi)某些含量特別低的物質(zhì)尚不能測(cè)定。

　　4．由于放射免疫分析是競(jìng)爭(zhēng)性的反應(yīng)，被測(cè)物和標(biāo)準(zhǔn)物都不能全部參與反應(yīng)，測(cè)得的值是相對(duì)量而非絕對(duì)量。

　　5．存在放射線(xiàn)輻射和污染等問(wèn)題。

　　盡管RIA存在以上缺點(diǎn)，但它畢竟是定量分析方法的技術(shù)。隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，放射免疫分析技術(shù)將會(huì)得到更加廣泛、更加深入的發(fā)展。

　　二、基本原理

　　放射免疫分析技術(shù)，是把放射性同位素測(cè)定與抗原、抗體間的免疫化學(xué)反應(yīng)兩種方法巧妙地結(jié)合起來(lái)所形成的一種超微量物質(zhì)的測(cè)定方法。

　　RIA的基本原理，是利用標(biāo)記抗原（*Ag）和非標(biāo)記抗原（Ag）對(duì)特異性抗體（Ab）發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合。競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)可用下式表示：

　　在上述反應(yīng)系統(tǒng)中，當(dāng)只有*Ag和Ab時(shí)，只產(chǎn)生*Ag—Ab復(fù)合物，并保持可逆的動(dòng)態(tài)平衡。如反應(yīng)系統(tǒng)中同時(shí)加入Ag,因Ag 與*Ag 免疫活性完全相同，故與Ab具有相同的親合力。當(dāng)*Ag為一定量、Ab為有限量、Ag 與* Ag 的量之和超過(guò)Ab上的有效結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，*Ag –Ab復(fù)合物的生成量與Ag 的量之間呈一定的函數(shù)關(guān)系。即當(dāng)Ag 量少時(shí)，Ag –Ab生成量多，而*Ag –Ab生成量增多，游離的*Ag 減少。可見(jiàn)*Ag –Ab復(fù)合物生成量是受Ag含量制約的。因此，在放射免疫分析中，用已知不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)物和一定量的*Ag及限量的Ab反應(yīng)，采取一定方法將B與F分開(kāi)，即可算出該標(biāo)準(zhǔn)物在各濃度下*Ag –Ab復(fù)合物的結(jié)合百分率（B/T）。

　　這一反應(yīng)過(guò)程，可用以下簡(jiǎn)圖（圖8-1）說(shuō)明。圖中黑圈表示標(biāo)記抗原，白圈表示非標(biāo)記抗原，長(zhǎng)條代表抗體，每個(gè)抗體有兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，標(biāo)記抗原與非標(biāo)記抗原對(duì)抗體有同等的結(jié)合能力。

　　從圖中可見(jiàn)，當(dāng)標(biāo)記抗原與抗體量一定時(shí)，結(jié)合率（B/B+F）隨抗原量增加而降低。在實(shí)際工作中，以B/T的值為縱座標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫座標(biāo)，繪成曲線(xiàn)，即競(jìng)爭(zhēng)性抑制曲線(xiàn)，或稱(chēng)準(zhǔn)確曲線(xiàn)。將未知濃度的樣品按同樣條件操作，所得結(jié)合率（%）與標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相比，即可查出樣品中待測(cè)抗原的濃度。

　　放射免疫分析典型的操作程序如下：首先配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并各取一定體積；于其中加入一定量的標(biāo)記抗原和特異性抗體；在一定條件下使之反應(yīng)平衡后，采取適當(dāng)方法將B與F分離；分別測(cè)量其放射性；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖8-2）。對(duì)樣品中抗原的測(cè)定，則可在同樣條件下操作，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上查得含量。

　　由此可見(jiàn)，要成功地進(jìn)行放射免疫分析，必須解決好以下3個(gè)關(guān)鍵性技術(shù)問(wèn)題：

　�。�1）標(biāo)記抗原：要求其純度高、免疫化學(xué)活性好、比放射性強(qiáng)、用量適當(dāng)。

　　（2）制備抗體：要求其特異性高、選用的稀釋度適當(dāng)。

　　（3）分離B與F：理想的分離方法應(yīng)當(dāng)是分離完全、穩(wěn)定可靠、操作簡(jiǎn)單、適用范圍廣。

第二節(jié)　放射性碘標(biāo)記

　　在RIA中，標(biāo)記抗原質(zhì)量的優(yōu)劣，直接影響測(cè)定結(jié)果，必須制備比放射性強(qiáng)、純度高的標(biāo)記抗原，并保持免疫活性不受喪失。

　　一、同位素的選擇

　　同位素有穩(wěn)定性和放射性?xún)煞N。放射性同位素可利用其衰變時(shí)放出的放射線(xiàn)進(jìn)行測(cè)量，這種測(cè)量較靈敏而方便，故多用放射性同位素。標(biāo)記抗原，常用的放射性同位素有³H、¹⁴C、¹³¹I和¹²⁵I等。在使用上各有其優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)所進(jìn)行的放射免疫分析的類(lèi)型特點(diǎn)，標(biāo)記物制備和供應(yīng)情況以及實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件等作適當(dāng)?shù)倪x擇（表8-1）。大多數(shù)抗原分子中都含有C、H等原子，所以用¹⁴C或³H標(biāo)記不改變抗原的結(jié)構(gòu)及其免疫學(xué)活性，且¹⁴C、³H半衰期長(zhǎng)，所標(biāo)記的抗原長(zhǎng)時(shí)間放置后仍可使用，這都是其優(yōu)點(diǎn)。¹⁴C或³H標(biāo)記的不足之處是操作較繁瑣，并難以獲得高比放射性的標(biāo)記物；³H及¹⁴C放出的都是弱β射線(xiàn)，需用較昂貴的液體閃爍計(jì)數(shù)器方能獲得較高效率的測(cè)量，且測(cè)定操作也較麻煩。但某些抗原用放射性碘標(biāo)記容易喪失免疫化學(xué)或生物學(xué)活性者，則仍以采用³H或¹⁴C標(biāo)記物為佳。

表8-1 標(biāo)記抗原常用的放射性同位素及其性質(zhì)

　　大多數(shù)抗原分子中是不含碘的,引入碘原子就改變了抗原的分子結(jié)構(gòu)，往往容易損傷抗原的免疫化學(xué)活性；且放射性碘的半衰期較短，標(biāo)記物放置后因衰變使放射性降低，因而需要經(jīng)常制備標(biāo)記物或要求能定期提供放射性碘標(biāo)記都能適用，放射性碘放出γ—射線(xiàn)，用一般晶體閃爍計(jì)數(shù)器就能獲得較高效率而精確的測(cè)量，測(cè)量操作也很簡(jiǎn)單。由于這些突出的優(yōu)點(diǎn)，目前在放射免疫分析中，使用放射性碘標(biāo)記物*多。

　　從應(yīng)用角度來(lái)看，¹³¹I和¹²⁵I又各有其優(yōu)缺點(diǎn)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)的要求、儀器的條件和放射性碘制劑的規(guī)格等條件合理選用。但相對(duì)而言，¹²⁵I有較多的優(yōu)點(diǎn)，一是半衰期適中，允許標(biāo)記化合物的商品化及貯存應(yīng)用一段時(shí)間；二是它只發(fā)射28keV能量的X射線(xiàn)和35keV能量的γ射線(xiàn)，而無(wú)β粒子，因而輻射自分解少，標(biāo)記化合物有足夠的穩(wěn)定性。放射性碘適用于放射免疫分析許多對(duì)象（包括蛋白質(zhì)、肽類(lèi)、固醇類(lèi)、核酸類(lèi)以及環(huán)型核苷酸衍生物等）的標(biāo)記，且操作簡(jiǎn)單，一般實(shí)驗(yàn)室都不難做到。

　　二、蛋白質(zhì)與多肽激素的放射性碘標(biāo)記

　　要制備高比度、高純度與免疫化學(xué)活性好的標(biāo)記物，首先要有高純度、良好免疫活性的抗原。用作放射標(biāo)記加網(wǎng)免疫分析的特異性，所以若用純度不高的抗原作標(biāo)記，則標(biāo)記后必須采取適當(dāng)?shù)牟襟E除去雜質(zhì)，以獲得高純度的標(biāo)記物。標(biāo)記對(duì)象的純化應(yīng)盡量采用溫和的方法，否則在純化操作中已受潛在性損傷的蛋白質(zhì)（這時(shí)表面上活性可能還是良好的），再經(jīng)標(biāo)記反應(yīng)時(shí)所受的損傷，活性就會(huì)顯著降低，影響以后的放射分析結(jié)果。有了好的純抗原，還要采用適當(dāng)方法加以標(biāo)記，盡量獲取高比放射性、而又能保持良好的特異免疫化學(xué)活性的標(biāo)記物。這些都是放射免疫分析能取得高特異性和高靈敏度的關(guān)鍵問(wèn)題。

　　多肽激素與蛋白質(zhì)多用碘標(biāo)記，*常用的是¹²⁵I。碘化反應(yīng)的基本過(guò)程如下：通過(guò)氧化劑的作用，使碘化物（¹²⁵I^-）氧化成的碘分子（¹²⁵I₂），再與多肽激素、蛋白質(zhì)分子中的酪氨酸殘基發(fā)生碘化作用。所以不管采用哪一種放射性碘標(biāo)記法，標(biāo)記的化合物內(nèi)部必須有碘原子可結(jié)合的基團(tuán)，即結(jié)構(gòu)上要含有酪胺基或組織胺殘基。凡蛋白質(zhì)、肽類(lèi)等抗原，在結(jié)構(gòu)上含有上述基團(tuán)的可直接用放射性碘進(jìn)行標(biāo)記。如不含上述基團(tuán)的，放射性碘無(wú)法標(biāo)記，必須在這些化合物的結(jié)構(gòu)上連接上述基團(tuán)后才能進(jìn)行碘標(biāo)記。

　　因此影響蛋白質(zhì)、多肽碘化效率的因素，主要決定于蛋白質(zhì)、多肽分子中酪氨酸殘基的數(shù)量及它們?cè)诜肿咏Y(jié)構(gòu)中暴露的程度；此外，碘化物的用量、反應(yīng)條件（pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間等）及所用氧化劑的性質(zhì)等也有影響。

　　常用的標(biāo)記方法有：

　　（一）氯胺T法

　　氯胺T法標(biāo)記效率高、重復(fù)性好、試劑便宜易得，是目前使用*多的碘標(biāo)記方法。

　　1．原理氯氨—T（Chloramine－－T）是一種溫和的氧化劑，在水溶液中產(chǎn)生次氯酸，可使碘陰離子氧化成碘分子。這活性碘可取代肽鏈上酪氨酸苯環(huán)上羥基位的一個(gè)或兩個(gè)氫，使之成為含有放射性碘化酪氨酸的多肽鏈。

　　2．方法以¹²⁵I—AVP的制備為例。

　�。�1）碘化反應(yīng)：AVP5μg+0.5mol/l PB50μl（pH7.5）+¹²⁵1800μCi,混合后，加入新配置的Ch—t 30μg/15μl（0.05mol/l PB, pH7.5）。迅速振蕩混勻，室溫下反應(yīng)40s。

　�。�2）終止碘化反應(yīng)：加入還原劑偏重亞硫酸鈉40μg/20μl（0.05mol/l PB, pH7.5）,以終止碘化反應(yīng)。

　�。�3）Bio—Gel P₂層析純化：將碘化反應(yīng)混合液注入Bio—Gel P₂柱，用0.1n HAC溶液洗脫，分部收集，每2min收集一管，共收集60管。

　�。�4）放射性測(cè)量：測(cè)定各收集管的放射性，出現(xiàn)兩個(gè)峰，峰為¹²⁵I—AVP，第二峰為游離碘鹽峰。個(gè)峰中計(jì)算的幾管，留下備用。

　　為了解標(biāo)記抗原的質(zhì)量，每次碘標(biāo)記后應(yīng)計(jì)算出碘的利用率，標(biāo)記上多少放射性碘，以及每微克抗原結(jié)合上多少放射性碘。

　�。�5）標(biāo)記抗原的貯存：經(jīng)純化與檢查后的標(biāo)記物、加入1/8體積的異丙醇，分成若干小份，置于鉛罐中，在-20℃以下的冰箱中貯存?zhèn)溆�，�?yīng)避免反復(fù)凍融。標(biāo)記抗原在貯存中是不穩(wěn)定的，這是因?yàn)椋阂皇敲摰�，�?biāo)記的碘從原來(lái)位置上脫落，變成游離碘；二是蛋白損傷、變性，成為聚合大分子或斷鍵成小分子碎片。由于上述原因，使B/F明顯降低，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率變小，以致不能使用，故需分離純化，其方法是用Sephadex G100長(zhǎng)柱（40～80cm ）過(guò)柱，洗脫后出現(xiàn)3個(gè)峰。第1個(gè)峰分子量大，是蛋白變性的聚合的大分子，尚保留部分抗原決定簇，免疫活性弱；第2個(gè)峰是純抗原的蛋白峰，免疫活性好；第3個(gè)峰是游離¹²⁵I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個(gè)純抗原蛋白峰，免疫活性好；第3個(gè)峰是游離¹²⁵I或小分子碎片，不具備免疫活性。收集到的第2個(gè)純抗原蛋白峰，其性能類(lèi)似于新鮮標(biāo)記的抗原。分離純化的方法解決了標(biāo)記抗原的貯存、長(zhǎng)期使用問(wèn)題，特別對(duì)來(lái)之不易的抗原更顯得重要。

　　2．注意事項(xiàng)

　�。�1）放射性碘源的選用：無(wú)載體的¹³¹I或¹²⁵I均可用于碘化標(biāo)記，但應(yīng)盡量選用新鮮的、比放射強(qiáng)度高的、含還原劑量少的放射性碘源。碘源的比放射強(qiáng)度≥50～100mCi/ml，至少也要>30mCi/ml，否則加入碘源的容量要增加，隨著帶入碘源中含有的還原劑（為放射性碘源運(yùn)輸保存所需加入）量也增加，這將會(huì)顯著降低碘利用率及標(biāo)記蛋白比放射強(qiáng)度。放置較久和放射性碘源，一方面因衰變致比放射強(qiáng)度降低，另一方面因水的輻射化學(xué)產(chǎn)物增多（主要是¹³¹I源），都會(huì)降低標(biāo)記時(shí)的碘利用率。放射性碘源含還原劑（如Na₂S₂O₅等）量多時(shí)，會(huì)抵消氯胺T的作用，降低碘利用率，甚至導(dǎo)致標(biāo)記完全失敗。放射性碘源要用無(wú)載體的，標(biāo)記所用全部用具和試劑必須不含碘；只要有極少量的碘的污染，非放射性碘就會(huì)稀釋放射性碘，使放射性碘利用率顯著降低。為了便于放射性防護(hù)和除污染，以及減少射線(xiàn)對(duì)蛋白質(zhì)分子的損傷，標(biāo)記投入的放射碘量不宜過(guò)大，一般以<5mCi為宜。

　�。�2）放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比例：這比例對(duì)標(biāo)記結(jié)果的影響很大。如上述原因，一般標(biāo)記時(shí)放射性投入量不宜過(guò)多，示蹤實(shí)驗(yàn)室中常規(guī)每次只用1～2mCi，因而放射性碘與多肽、蛋白質(zhì)用量的比值主要靠標(biāo)記時(shí)投入的多肽、蛋白質(zhì)用量來(lái)控制。當(dāng)投入的放射碘量一定時(shí)，多肽、蛋白質(zhì)用量多（即I/多肽、蛋白質(zhì)比值低），能獲得高碘利用率，但所得標(biāo)記蛋白比放射強(qiáng)度低；相反多肽、蛋白質(zhì)用量少（即I/多肽、蛋白質(zhì)比值高），則碘利用率降低，但所得標(biāo)記多肽、蛋白比放射性隨此比值變化都有較大的變動(dòng)；而當(dāng)此比值<1后，則碘利用率再下降的幅率較小，標(biāo)記多肽、蛋白比放射性也不會(huì)再增加多少。

　�。�3）氯胺T與偏重亞硫酸鈉的用量及碘化反應(yīng)時(shí)間：氧化碘化標(biāo)記法中，會(huì)導(dǎo)致失活的*主要原因是氧化還原。氯胺T是氧化劑，早期用氯胺T法作碘化標(biāo)記時(shí)氯胺T用量都比較大，或碘化反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，結(jié)果導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和活性的嚴(yán)重?fù)p傷。氯胺T用量大，或長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)行碘化反應(yīng)，結(jié)果并不能使碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)比放射強(qiáng)度提高多少，反而使標(biāo)記多肽、蛋白活性下降。當(dāng)用不含還原劑或還原劑很少的放射性碘源時(shí)，試以各種蛋白質(zhì)（包括白蛋白、球蛋白、ACTH、胰島素等）作微量標(biāo)記，當(dāng)氯胺T用量為20μg/0.1ml反應(yīng)液、0～20^。C反應(yīng)20s，碘利用率都已接近或達(dá)到峰，再加大氯胺T用量和延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間是沒(méi)有必要的。隨放射性碘源中還原劑增多，氯胺T用量也應(yīng)增加，以達(dá)到預(yù)期的碘利用率，但決不應(yīng)盲目加大氯胺T用量和延長(zhǎng)碘化反應(yīng)時(shí)間（通常反應(yīng)時(shí)間不要超過(guò)1min），否則會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)嚴(yán)重失活，不能用于實(shí)驗(yàn)。當(dāng)然，減少氯胺T用量要在了解放射性碘源還原劑含量的基礎(chǔ)上，否則碘源中還原劑量較多，雙盲目減少氯胺T用量，就會(huì)使標(biāo)記失敗。一般用¹²⁵I標(biāo)記時(shí)，氯胺T用量要適當(dāng)加大。加入氯胺T后必須迅速混勻，以防標(biāo)記不均勻。氯胺T與偏重亞硫酸鈉溶液要新配制的。

　　氯胺T用量減少了，Na₂S₂O₅用量也就可以隨之減少。為保證按時(shí)終止碘化反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)時(shí)加入Na₂S₂O₅一般都是過(guò)量的。氯胺T用量大時(shí)，加入Na₂S₂O₅的剩余量也就會(huì)隨之增加，這就可能加重某些對(duì)還原劑敏感的蛋白質(zhì)或多肽生物活性的損傷。為此，Na₂S₂O₅用量也不應(yīng)過(guò)多。只要藥品沒(méi)有變質(zhì)、試劑是新配的，以重量計(jì)算Na₂S₂O₅加入量與氯胺T相同就足以保證終止碘化反應(yīng)（按反應(yīng)克分子濃度計(jì)算，Na₂S₂O₅/氯胺T重量比約0.4），不要盲目加大用量，并應(yīng)迅速將標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)從反應(yīng)液中分離出來(lái)，以盡量減少多肽、蛋白質(zhì)活性的損傷。

　　某些蛋白質(zhì)或多肽對(duì)氯胺T較敏感，還可進(jìn)一步減少氯胺T用量、縮短碘化反應(yīng)時(shí)間、降低反應(yīng)溫度，以保護(hù)蛋白質(zhì)的活性。這對(duì)一些較容易喪失活性蛋白質(zhì)或多肽的碘標(biāo)記十分重要。

　�。�4）碘化反應(yīng)體積：系指加入Na₂S₂O₅終止反應(yīng)前液體的總量。碘化反應(yīng)體積愈小，局部反應(yīng)物濃度愈高，所得碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白比放射強(qiáng)度就愈高。所以，標(biāo)記應(yīng)采用比放射標(biāo)記效果。當(dāng)反應(yīng)液量少（<0.2～0.3ml）時(shí)，反應(yīng)體積對(duì)碘利用率和標(biāo)記多肽、蛋白質(zhì)比放射強(qiáng)度的高低影響較大；當(dāng)反應(yīng)液量大（>0.5～1.0ml）時(shí)則影響較小。微量氯胺T法放射碘標(biāo)記時(shí)，一般多控制碘化反應(yīng)體積<100μl。

　�。�5）碘化反應(yīng)溫度：溫度升高，碘化反應(yīng)速度加快，碘利用率有所增加。但總的來(lái)看，反應(yīng)溫度的影響不很大，一般從0^℃到20℃碘利用率相差不過(guò)百分之幾，故一般在室溫下進(jìn)行標(biāo)記操作就可能獲得重復(fù)性好的結(jié)果。有些蛋白質(zhì)或肽類(lèi)極易喪失活性，則可在0℃進(jìn)行碘化反應(yīng)。

　�。�6）碘化反應(yīng)的pH值：受氧化劑氧化生成的活性碘，對(duì)多肽鏈的酪氨酸基苯環(huán)羥基鄰位的碘化作用，*適pH是7.3～7.8之間。當(dāng)pH變化時(shí)，碘化位置也會(huì)發(fā)生變化，例如pH值較高時(shí)，組氧酸的咪唑環(huán)也可被碘化；當(dāng)pH4～5時(shí)，活性碘能迅速氧化色氨酸基生成羥基吲哚，導(dǎo)致肽鏈斷裂。這些都會(huì)影響蛋白質(zhì)或多肽的放射性碘化反應(yīng)，或引起降解或失活。因此作放射性碘化標(biāo)記時(shí)，除放射性碘源外，所有的試劑都應(yīng)用適當(dāng)?shù)木彌_液配制，保證碘化反應(yīng)在*佳pH條件下進(jìn)行。

　�。�7）微量蛋白質(zhì)或多肽的吸附損失：界面的吸附損失，在使用大量蛋白質(zhì)或多肽類(lèi)時(shí)是可以忽略的，但作微量法標(biāo)記時(shí)投入的蛋白質(zhì)或多肽類(lèi)只在微克甚至毫克甚至毫微克水平，界面吸附導(dǎo)致的損失就不能忽略。例如制備¹³¹I—ACTH時(shí)，所用ACTH濃度低到50Pg/ml時(shí)，因表面吸附可損失10%～30%，甚至高達(dá)75%。改變pH、加入非特異性載體蛋白、或使用聚苯乙烯、聚乙烯容器時(shí)，能減少吸附，但不能完全消除。一般殘留在反應(yīng)管和滴管上的放射性為投入總放射性的2%～8%、殘留在層析柱上折占5%～10%。殘留量隨標(biāo)記蛋白比放射性強(qiáng)度而直線(xiàn)增減，殘留者幾乎全部都是標(biāo)記蛋白。由此可見(jiàn)，微量蛋白質(zhì)或多肽受吸附而損失的量是不容忽略的。由于微量蛋白質(zhì)、多肽會(huì)被顯著吸附而丟失，所以標(biāo)記時(shí)投入蛋白質(zhì)、多肽量過(guò)微（如<2μg）也是不適宜的，否則標(biāo)記蛋白質(zhì)、多肽的收回率會(huì)太低，并在計(jì)算上會(huì)造成較大的誤差。

　�。�8）不同蛋白質(zhì)、多肽碘化標(biāo)記的差別：由于不同的蛋白質(zhì)和多肽分子中含有的酪氨酸數(shù)目不同，而且其空間結(jié)構(gòu)也不相同，分子中的酪按酸殘基有的容易發(fā)生碘化反應(yīng)，有的就不容易碘化，因此同樣條件下進(jìn)行碘化標(biāo)記，不同蛋白質(zhì)或多肽對(duì)碘的利用率是不相同的。不同蛋白質(zhì)經(jīng)碘化標(biāo)記后生物活性受損的情況也各不相同。例如ACTH、促性腺激素釋放激素（GRH）、促黃體激素釋放激素（LRH）等多肽，碘化標(biāo)記后容易喪失激素活性或與受體結(jié)合的活性；而AFP及人絨毛膜促性腺激素（HCG）等的碘化標(biāo)記，則較容易保存良好的免疫化學(xué)活性。

　　盡管不同多肽、蛋白度的碘化標(biāo)記結(jié)果有所差別，但上述討論的因素對(duì)不同多肽、蛋白質(zhì)碘化標(biāo)記的影響有共同的規(guī)律。掌握了這些因素，就容易成功地獲得合格的標(biāo)記物。

　　不同多肽、蛋白質(zhì)的分子量大小、理化性質(zhì)各不相同，放射碘化標(biāo)記反應(yīng)后，可根據(jù)具體情況采取不同的方法將標(biāo)記蛋白質(zhì)（或多肽）與未反應(yīng)的游離放射性碘及受損傷的標(biāo)記物分開(kāi)，常用的方法有凝膠過(guò)濾、離子交換層析、吸附層析、各種電泳法等。

　�。ǘ�）乳過(guò)氧化物酶法（LPO）

　　本法反應(yīng)溫和，對(duì)抗原、抗體免疫活性影響小，已被廣泛應(yīng)用。缺點(diǎn)是標(biāo)記率較低，一般為20～40%。

　　1．原理此法是利用乳過(guò)氧化物酶（Lactoperoxidase）有促進(jìn)微量過(guò)氧化氫對(duì)¹²⁵I^-的氧化作用，生成¹²⁵I⁺，并標(biāo)記在多肽、蛋白質(zhì)酪氨酸分子上。

　　2．方法以標(biāo)記蛋白質(zhì)抗原為例。

　　（1）反應(yīng)液組成：蛋白質(zhì)2～5μg溶于磷酸緩沖液10～25μl中，加入Na¹²⁵i 1m Ci（10μl）、乳過(guò)氧化物酶溶液25ng（10μl）、H₂O₂200ng（10μl）；

　�。�2）在室溫保溫7min；

　�。�3）加入H₂O₂200ng（10μl）；

　�。�4）過(guò)7min再加入H₂O₂（3μl）；

　�。�5）保溫7min后，加入0.5ml、10mmol/L巰基乙醇以停止反應(yīng)；

　�。�6）10min后加入NaI載體溶液1ml ；

　�。�7）按常規(guī)方法分離純化。

　　3．注意事項(xiàng)

　�。�1）LPO質(zhì)量好壞，可直接影響標(biāo)記率，LPO應(yīng)在使用前新鮮配制，以防酶活性降低。

　�。�2）LPO用量應(yīng)小于總蛋白質(zhì)用量的1%，以減少酶自身碘化而帶入的放化雜質(zhì)。

　�。�3）碘化反應(yīng)速率分析表明，酶的催化速度很快。

　�。�4）碘化反應(yīng)在pH4.0～8.5較寬范圍內(nèi)均可進(jìn)行，*適pH值應(yīng)依據(jù)蛋白質(zhì)本身性質(zhì)而定。

　　（5）H₂O₂應(yīng)保持低濃度，如高于0.1mmol/L，對(duì)酶的活性將有抑制作用。

　�。ㄈ�）Iodogen碘化法

　　此法具有標(biāo)記率高、反應(yīng)體積�。�3ml水平）、可用低濃度的¹²⁵I原料、對(duì)多肽激素和蛋白質(zhì)的免疫活性損失小、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，系常規(guī)的碘化方法。

　　1．原理　用Iodogen為氧化劑，對(duì)蛋白質(zhì)和多肽抗原進(jìn)行碘化標(biāo)記，把¹²⁵I直接引進(jìn)分子中的酪氨酸殘基上。標(biāo)記過(guò)程中被標(biāo)記樣品不與Iodogen混合，標(biāo)記后取出樣品即停止反應(yīng)，不使用任何還原劑。

　　2．方法

　�。�1）標(biāo)記之前，先把Iodogen溶于有機(jī)溶劑，涂于管底，并使之干燥。

　　（2）標(biāo)記時(shí)，將蛋白質(zhì)溶液10～20μg/10μl（0.5mol/L,pH7.5PB）置于反應(yīng)管中，反應(yīng)管置于冰浴中。碘化時(shí)，¹²⁵I與蛋白質(zhì)克分子之比例為1～1.2。反應(yīng)時(shí)間在溫和的連續(xù)的攪拌下可達(dá)10min，從反應(yīng)管中轉(zhuǎn)移出反應(yīng)混合液，使其反應(yīng)停止。反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到含有200μl0.01mol/L、pH7.2PB和0.15mol/L NaCl溶液中，層析分離前再放置5min，使其未標(biāo)記的碘離子還原成分子碘，以避免在帶有緩沖液的柱中使白蛋白碘化。

　　3．注意事項(xiàng)

　�。�1）涂有Iodogen的反應(yīng)管，有氮?dú)庵忻芊�，并貯存在-20^℃條件下，至少可用3個(gè)月。打開(kāi)管，使用時(shí)間很短。

　�。�2）碘化反應(yīng)時(shí)間，7min時(shí)標(biāo)記率達(dá)，10min時(shí)略有減少。PH6.0～8.5時(shí)，標(biāo)記率。

　�。�3）Iodogen與蛋白質(zhì)的比率是標(biāo)記率的函數(shù)。的標(biāo)記率是1克分子的Iodogen與8克分子或再多量之比。

　　（四）�；�試劑（Bolton和Hunter試劑）法

　　1．原理這個(gè)方法用酰化劑3－－（4-羥苯基）丙酸—N琥珀酰胺酯（Bolton—Hunter試劑）做連接試劑，將¹²⁵I標(biāo)記在羥苯基的2，5位置上，再將琥珀酰胺酯水解，通過(guò)一個(gè)酰氨鍵將3－－（4—羥基—5—¹²⁵I—苯基）接在蛋白或多肽的末端氨基上。

　　2．方法¹²⁵I—Bolton—Hunter試劑可用氯胺T法自行制備，出已有該試劑的苯溶液作為商品出售。使用時(shí)取一定量的標(biāo)記酯（μmol 蛋白用3～5μmol標(biāo)記酯），用氮?dú)獯党���，投入欲�?biāo)記蛋白5～10μg及緩沖液10～50μl,pH8.0～8.5為宜，在冰浴中反應(yīng)15～30min后，加入多量氨基酸（如甘氨酸），使過(guò)量標(biāo)記酯消耗掉以終止反應(yīng)。

　　此法避免了蛋白質(zhì)與氧化劑的接觸，又避免了與放射性碘原子的直接接觸，可防止碘源中有害物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)的損傷，適用于標(biāo)記缺乏酪氨酸的蛋白質(zhì)或酪氨酸在活性中心，引入碘原子后會(huì)引起蛋白質(zhì)的失活。其缺點(diǎn)是標(biāo)記技術(shù)比較復(fù)雜，需要接觸較多的放射性，經(jīng)二步反應(yīng)，碘標(biāo)記率比較低。一般認(rèn)為此法不宜標(biāo)記短肽，而適于分子量大于1萬(wàn)的蛋白質(zhì)。

　　三、放射性標(biāo)記化合物的純化與鑒定

　　（一）純化標(biāo)記化合物的常用方法

　　不論使用何種制備方法，要獲得合格的標(biāo)記化合物，都必須將反應(yīng)物經(jīng)過(guò)仔細(xì)的分離、純化。另外，一些標(biāo)記化合物，經(jīng)過(guò)一定時(shí)間的存放后，往往會(huì)出現(xiàn)不純物，而需再純化。如碘標(biāo)記生長(zhǎng)激素（¹²⁵－－HGH）,在剛標(biāo)記的第2天，從Sephadex G-100過(guò)濾譜上可見(jiàn)，幾乎所有的碘化HGH都集中在峰II；保存1個(gè)月后，峰II組份減少，峰I和峰III成分明顯增加，峰I是集聚的標(biāo)記生長(zhǎng)激素，而峰III是不具有免疫活性的放射性化學(xué)雜質(zhì)（圖8－－3）。

圖8－3　¹²⁵I—HGH的Sephadex G-100過(guò)濾譜

實(shí)線(xiàn)：新鮮制備的 125I—HGH　虛線(xiàn)：保存1個(gè)月的125I—HGH

　　標(biāo)記化合物的純化方法，除制備比活度低而化學(xué)量又較多的標(biāo)記物可用重結(jié)晶、蒸餾、萃取等常規(guī)方法外，一般需用微量分離技術(shù)，較方便的是層析法、離子交換法、凝膠過(guò)濾及高效液相層析法等�，F(xiàn)以碘標(biāo)記蛋白為例，說(shuō)明以上各種方法的適用情況。

　　1．凝膠過(guò)濾法常用的是Sephadex G系列，也有Biogel—P系列。分離標(biāo)記蛋白與無(wú)機(jī)碘時(shí)，通常用Sephadex G—25或G—50，然后用G—100進(jìn)一步純化。

　　2．離子交換法一般是制成離子交換層析柱，用于分離純化短肽標(biāo)記物。

　　3．透析法　能將標(biāo)記蛋白與小分子化合物很好地分離。

　　4．電泳法可用來(lái)分離單碘化、多碘化及已受損傷的蛋白質(zhì)。

　　5．親和層析法利用蛋白質(zhì)與其特異抗體或受體的結(jié)合來(lái)分離、純化標(biāo)記蛋白質(zhì)。此法特異性強(qiáng)，保持生物活性好，但操作較復(fù)雜。

　　6．高效液相層析法此法優(yōu)點(diǎn)是分離效果好、快速，但需特殊設(shè)備。

　　7．伴刀豆球蛋白A（ConA）吸附法ConA是一種植物凝集素，對(duì)糖蛋白有良好吸附能力，因此適于分離標(biāo)記糖蛋白。吸附的標(biāo)記糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脫。

　　（二）標(biāo)記化合物的主要質(zhì)量指標(biāo)

　　作為示蹤劑及分析試劑的標(biāo)記化合物，應(yīng)具有比一般非標(biāo)記化合物更高的質(zhì)量要求。標(biāo)記化合物的質(zhì)量指標(biāo)包括：放射性核純度、放射化學(xué)純度、放射性比活度、生物活性和免疫活性以及標(biāo)記位置和定量分布情況等。

　　1．放射性核純度及其檢查方法

　�。�1）放射性核純芳可用下式表示：

　　放射性核純度（%）=所需放射性核素的活度/樣品的總放射性活度×100

　　（2）放射性核純度的檢查方法：每一種核素都有它的特征，即物理半衰期及射線(xiàn)能量，故可通過(guò)半衰期及射線(xiàn)能量的測(cè)定來(lái)鑒別所需放射性核的純度。

　�、贉y(cè)定半衰期法：如短半衰期放射性核素，一般可采用時(shí)間跟蹤法，每隔一定時(shí)間測(cè)量放射性一次，共測(cè)3～5個(gè)半衰期，以每次測(cè)得的放射性計(jì)數(shù)為縱座標(biāo)，時(shí)間為橫座標(biāo)，在半對(duì)數(shù)紙上作圖，并通過(guò)分析，可求出該放射性核素的純度。

　　②測(cè)定射線(xiàn)能量法：利用每一放射性核素的特征射線(xiàn)譜來(lái)檢查放射性核純度。γ發(fā)射體可用γ能譜儀，如檢測(cè)⁵⁷Co和⁵⁸Co的核純度：純β-發(fā)射體可用液閃儀，調(diào)節(jié)　道寬及淬火校正后，對(duì)如³H、¹⁴C、³²P的核純度進(jìn)行測(cè)量；而β、γ混雜垓素，則用吸收法測(cè)量，如^99mrTc中母體雜質(zhì)^99mMo的含量測(cè)量，是通過(guò)適當(dāng)厚度的鉛屏蔽，將^99mTc 發(fā)射的能量為141ke V的γ射線(xiàn)減弱后，測(cè)定⁹⁹Mo發(fā)射的能量為739Kev 的γ射線(xiàn)。

　　2．放射化學(xué)純度及放化純度鑒定

　�。�1）放射化學(xué)純度：放射性核素標(biāo)記化合物都是以一定的化學(xué)形態(tài)存在的，所以：

　　放射化學(xué)純度（%）特定化學(xué)形態(tài)的放射性活度/樣品總放射性活度×100

　　放射化學(xué)純度受制備方法及原料的化學(xué)純度、產(chǎn)物存放條件等影響，一般放化純度控制在95%以上。

　�。�2）放射化學(xué)純度的測(cè)定方法：原則是高效的化學(xué)分離與靈敏的放射性測(cè)量相結(jié)合。常用下列方法：

　�、俜派鋵游龇�，又稱(chēng)放射色譜法：本法是利用色譜技術(shù)使混合物中各組份分離，然后測(cè)定各組份的放射性活度。它具有選擇性高、分離效果好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，在放化純度鑒定中是一種重要的分析方法。*常用的是放射性紙層析法和放射性薄層層析法。

　�、诜派湫愿咝б合鄬游龇ǎ核鼘�(duì)分離純化標(biāo)記化合物及鑒定標(biāo)記化合物的放化純度都有很大潛力，具有分析速度快、分離效率高、適用范圍廣等特點(diǎn)（幾乎80%的有機(jī)化合物均可應(yīng)用）。關(guān)鍵是要選擇合適的固定相和流動(dòng)相，使產(chǎn)品與雜質(zhì)分離。在流動(dòng)相中，被分析物各組份的濃度變化可用紫外或熒光檢測(cè)器檢測(cè)，而其放射性活度，可同時(shí)由放射性探測(cè)儀測(cè)定。放射性活度測(cè)定*簡(jiǎn)單的一種辦法，是將洗脫液分部收集，然后在γ儀或液閃儀上進(jìn)行測(cè)量；另一種較理想的是連續(xù)測(cè)量，在洗脫液流通池外包圍一個(gè)固體閃爍探頭，進(jìn)行γ計(jì)數(shù)或在流通池前加一個(gè)三通混合室，用另一個(gè)泵混入閃爍液，測(cè)定軟β射線(xiàn)�？梢耘c紫外控測(cè)器的掃描圖，同步描繪出放射性的分布圖。

　�、鄯派湫院怂胤聪♂尫ǎ喝∫欢�量（W₁）已測(cè)定比活度（S_O）的標(biāo)記化合物（約0.1～10mg），用>1000倍化學(xué)量（W₂）的純載體稀釋?zhuān)�充分混勻后反�?fù)純化到比活度恒定不變（Sp），此標(biāo)記化合物的放化純度值應(yīng)為：

　　有時(shí)該值>100%時(shí)，往往是由于所用載體化學(xué)純度不夠。因本法操作要求嚴(yán)格，一般不作常規(guī)放化純度鑒定用。

　　3．化學(xué)純度及化學(xué)量的測(cè)定標(biāo)記化合物中的非放射性化學(xué)雜質(zhì)雖一般不會(huì)對(duì)示蹤結(jié)果帶來(lái)直接干擾，然而這種雜質(zhì)的含量越多對(duì)標(biāo)記化合物在使用、存放過(guò)程中分解、變性的影響就越大。此外，也已發(fā)現(xiàn)某些標(biāo)記化合物的化學(xué)雜質(zhì)會(huì)給使用帶來(lái)直接影響。如用氚標(biāo)記類(lèi)固醇作放射免疫分析試劑，其中的化學(xué)雜質(zhì)會(huì)影響標(biāo)記抗原與抗體的結(jié)合率，使分析靈敏度降低。因此，對(duì)標(biāo)記化合物的化學(xué)雜質(zhì)含量，同樣必須加以控制。

　　要制得化學(xué)純度的標(biāo)記化合物，是對(duì)可能產(chǎn)生的雜質(zhì)加以防止。這要在冷試驗(yàn)中解決。因?yàn)槔湓囼?yàn)所得產(chǎn)品是非放射性的，其化學(xué)純度可用常規(guī)方法，如溶點(diǎn)、沸點(diǎn)測(cè)定，NMR、紅外、紫外譜分析等手段加以鑒定，得到合格產(chǎn)品后，再按同樣方法及條件進(jìn)行標(biāo)記制備。

　　對(duì)于標(biāo)記化合物的化學(xué)含量，則必需在標(biāo)記反應(yīng)及一定純化步驟后進(jìn)行，由于需要高比活度的標(biāo)記化合物，往往樣品的放射性很強(qiáng)，而化學(xué)量極微（如某氘標(biāo)記化合物，分子量為300，每分子上標(biāo)記2個(gè)氘原子，氘的同位素活度為99.8%，則理論上每25mCi（925MBq）的化學(xué)量還不足（130μg）,所以需用微量分析法才能測(cè)定其含量。一般而言，各種常規(guī)微量分析技術(shù)均可應(yīng)用。目前大多用紫外分光、熒光光度等進(jìn)行含量測(cè)定。

　　4．放射性比活度及其測(cè)定

　�。�1）放射性比活度簡(jiǎn)稱(chēng)比活度，過(guò)去也稱(chēng)比放射性。

　　比活度＝放射性活度／單位化學(xué)量

　�。�2）比活度的理論值計(jì)算：每種放射性核素有一個(gè)比活度理論值，取決于該核素的半衰期和衰變常數(shù)。若N是1毫克原子（1mA）的總原子數(shù)，衰變常數(shù)λ（單位時(shí)間衰變的%），則

　　任何元素每1mA的原子數(shù)都相同，等于阿伏加德羅常數(shù)，即6.023×10²⁰個(gè)，故

　　若T1/2min為單位，則上式的活度單位為dpm/mA,進(jìn)行單位換算后為：

　　根據(jù)上式，可計(jì)算出每種放射性核素比活度的理論值（常用放射性核素的比活度理論值見(jiàn)表8-2）。如果標(biāo)記化合物每分子接上一個(gè)放射性核素原子，則以上原論值亦為該標(biāo)記化合物的比活度（每毫摩爾的活度）理論值。

表8-2 一些常用放射性核素的比活度理論值

　　（亦即每分子一接一個(gè)該放射性核素原子的標(biāo)記化合物的經(jīng)活度理論值）

　�。�3）放射性比活度測(cè)定方法

　　①直接測(cè)定計(jì)算法：將標(biāo)記產(chǎn)品經(jīng)分離純化后，配成合適的溶液，測(cè)定每毫升的放射性活度（如mCi/ml）及含量（μg/ml）從而計(jì)算其比活度。對(duì)于高經(jīng)活度的標(biāo)記物，化學(xué)含量甚低，一般需用光譜法，如紫外分光光度法測(cè)定其含量。

　�、趯游鰭呙杳娣e計(jì)算法：一般應(yīng)用紙層析或薄層層析，將反應(yīng)結(jié)果尚未分離的反應(yīng)液點(diǎn)樣、展層，然后在掃描儀上描繪放射性分布圖，根據(jù)描繪的面積來(lái)進(jìn)行計(jì)算，如圖8-4。

₁為標(biāo)記物峰面積：

S₂S₃為雜質(zhì)峰及放射性原料峰面積

　　先計(jì)算標(biāo)記率：

　　放射性比活度的計(jì)算：若投入的待標(biāo)記物重量為W，且100%轉(zhuǎn)化為標(biāo)記物，則比活度=A·Y/W，其中A為投入的總放射性。

　　如果層析掃描儀有紫外監(jiān)測(cè)器和放射性活度計(jì)數(shù)率儀可同步測(cè)定掃描，則直接可給出比活度。

　�、圩陨砣〈���(jì)算法：這是間接測(cè)定標(biāo)記物比活度的方法。所測(cè)定的標(biāo)記物，需是分離純化后可用于RIA或RRA標(biāo)記試劑。

　　方法的原理是：作一條常規(guī)的RIA（或RRA）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，另作一條不加非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品，只加抗體和不同量標(biāo)記試劑的自身取代曲線(xiàn)。兩者用同一種抗體，且抗體用量完全相同。若反應(yīng)平衡后測(cè)定結(jié)合部分的放射性，掏算成所加總放射性（注意：對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)總說(shuō)總放射性各管相同，對(duì)自身取代曲線(xiàn)來(lái)說(shuō)各管不同，需分別換算）的百分?jǐn)?shù)，即結(jié)合率B。由于兩條曲線(xiàn)所用抗體的質(zhì)和量嚴(yán)格相同，標(biāo)記物與非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品與抗體親和力也相同，故B的大小就完全取決于各管中標(biāo)記物和非標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)品的總量。亦即若從兩標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上取一點(diǎn)相同的B，則

　�。���(biāo)記物+標(biāo)準(zhǔn)品）_{標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)}=（標(biāo)記物）_{自身取代曲線(xiàn)}

　　故由此便可直接計(jì)算標(biāo)記試劑的化學(xué)含量并進(jìn)一步求得比活度。為求準(zhǔn)確度高，可取我點(diǎn)B求出平均比活度。

　　用自身取代法測(cè)定標(biāo)記化合物的比活度，只適用于RIA的標(biāo)記抗原及受體的標(biāo)記配基。使用時(shí)應(yīng)注意：①標(biāo)記物與未標(biāo)記物對(duì)抗體（受體）的親和力應(yīng)相同；②非特異性結(jié)合應(yīng)較小，且計(jì)算時(shí)應(yīng)扣除；③制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與自身取代曲線(xiàn)時(shí)，操作步驟應(yīng)相同，特別是B與F分離的條件要一致。

　　5．生物活性、免疫活性測(cè)定

　�。�10）生物活性、免疫活性測(cè)定的重要性：放射性標(biāo)記化合物作為示蹤劑用于生物體內(nèi)的示蹤研究，或作為分析試劑用于生物活性物質(zhì)分析，都要求標(biāo)記化合物不改變其原有的生物活性和免疫活性。當(dāng)給化物引入放射性原子，即使“同位素標(biāo)記”大多需經(jīng)過(guò)原子交換或化學(xué)反應(yīng)及分離純化等物理化學(xué)處理，有可能造成光學(xué)構(gòu)型及立體構(gòu)型的改變而使標(biāo)記物改變性質(zhì)。“非同位素標(biāo)記”，如蛋白質(zhì)分子中引入碘原子，則更易引起蛋白質(zhì)失活、變性。故測(cè)定放射性標(biāo)記化合物的生物活性和免疫活性，對(duì)保證使用效果十分必要。

　　（2）生物活性和免疫活性測(cè)定的要求：需根據(jù)使用要求而定，因?yàn)橥�一�?biāo)記物其生物活性的變化與免疫活性的變化不一定相關(guān)；同一標(biāo)記激素，其與受體結(jié)合能力的改變與抗體結(jié)合能力的改變也不一定平行。

　�。�3）測(cè)定方法：測(cè)定標(biāo)記蛋白質(zhì)或多肽的生物活性和免疫活性常用的方法有下述幾種：

　　①物理化學(xué)方法：可用電泳法、吸附法及凝膠過(guò)濾法等物理化學(xué)方法來(lái)測(cè)定標(biāo)記蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變情況，如標(biāo)記后受損全傷的蛋白質(zhì)在電泳時(shí)泳動(dòng)性減少，碘化受損的多肽激素在血紅蛋白涂碳上的吸附性質(zhì)也有改變，而蛋白質(zhì)變性聚合時(shí)大分子聚合體將在凝膠過(guò)濾時(shí)不停留在凝膠柱上。這些測(cè)定雖較快速方便，但對(duì)標(biāo)記物的生物活性和免疫活性的嚴(yán)格判定來(lái)說(shuō)，還是很不夠的。

　�、谔禺惤Y(jié)合試驗(yàn)：根據(jù)放射性標(biāo)記化合物用于放射免疫分析等不同要求，分別與其相應(yīng)抗體或受體進(jìn)行特異性結(jié)合試驗(yàn)。以放射免疫分析試劑為例，測(cè)定其免疫活性的方法是：先觀(guān)察標(biāo)記物與抗體的結(jié)合率，如果結(jié)合率高，說(shuō)明抗原的免疫活性較好。進(jìn)一步觀(guān)察標(biāo)記抗原與非標(biāo)記對(duì)抗體親合力是否一致，做法是用不同稀釋度的抗體，分別與標(biāo)記抗原及與標(biāo)記抗原加非標(biāo)記抗原的混合物進(jìn)行特異結(jié)合，其中混合物抗原總濃度要和單獨(dú)使用放射性抗原的濃度相同。如單獨(dú)使用標(biāo)記抗原1.0ng,而混合抗原的總濃度亦為1.0ng，其中標(biāo)記抗原為0.1ng，非標(biāo)記抗原為0.9ng，比較兩者的結(jié)合率，如果基本相同，說(shuō)明標(biāo)記抗原保持其原來(lái)的親和力，在標(biāo)記等操作過(guò)程中未受到明顯損傷。如圖8-5中，A線(xiàn)與B線(xiàn)基本平行；如果標(biāo)記抗原免疫活性已有降低，則如C線(xiàn)所示。

　　A；為標(biāo)記抗原與血清的滴度曲線(xiàn)B：為非標(biāo)記抗原（加入少量標(biāo)記抗原）的滴度曲線(xiàn)；C：與A相同，但標(biāo)記抗原免疫活性已有降低

　�、凵�物特性測(cè)定：如¹²⁵I—纖維蛋白原，可用凝血酶測(cè)定其可凝能力，與非標(biāo)記物相比，視是否有改變。使用何種生物特性測(cè)定，根據(jù)標(biāo)記物的生物性質(zhì)而定。另外，上述特異性結(jié)合試驗(yàn)，如果受體作異結(jié)合劑，也是檢驗(yàn)用作RRA或RBA分析試劑的標(biāo)記物生物活性情況的有效方法。

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第三節(jié)　結(jié)合和游離部分的分離

　　放射免疫分析時(shí)加入的抗原和抗體的量極微，反應(yīng)所形成的復(fù)合物并不能成為肉眼所能辨認(rèn)的不溶性沉淀物，但是放射免疫分析必須分別測(cè)量與抗體結(jié)合的（B）和游離的（F）抗原，所以，B、F的分離是放射免疫分析中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)　。根據(jù)抗原—抗體復(fù)合物與游離抗原理化性質(zhì)或免疫學(xué)性質(zhì)的不同，可采取各種分離技術(shù)。

　　一、對(duì)分離方法的要求

　　分離方法的選擇直接影響分析的質(zhì)量，通常需滿(mǎn)足以下要求：

　�、偈笲和F分離完全；②不受外界因素的干擾而影響分離效果；③與游離抗原的非特異性作用盡可能��；④操作簡(jiǎn)便，分離迅速，重復(fù)性好，適用于大量樣品分析；⑤來(lái)源廣，價(jià)格低廉，便于使用，適合RIA技術(shù)自動(dòng)化。

　　二、常用的分離方法

　　目前用于放射免疫測(cè)定中的分離方法很多，各有其優(yōu)缺點(diǎn)，下面介紹幾種常見(jiàn)的分離方法：

　�。�1）吸附分離（固相顆粒）

　　活性碳吸附劑（目前常用）

　　硅鎂吸附劑（滑石粉等）

　　交換樹(shù)脂吸附劑

　�。�2）蛋白沉淀劑

　　硫酸銨、硫酸鈉

　　聚乙二醇（PEG）（目前常用）

　　無(wú)水乙醇、丙醇等

　�。�3）免疫分離劑（第二抗體）

　　（4）磁性分離劑

　　磁化活性碳吸附劑

　　磁化固相抗體

　�。�5）固相包被分離法（固相分離劑包被在測(cè)試管內(nèi)）

　　（一）吸附分離法

　　這種吸附分離劑是固相顆粒，它可以從反應(yīng)液中吸附游離抗原。

　　活性炭是常用的吸附劑。活性炭多用于小分子游離抗原和抗原—抗體復(fù)合物的分離。具體應(yīng)用時(shí)在活懷炭顆粒的表面涂上一層右旋糖酐或蛋白類(lèi)化合物。這樣活性炭末的表面構(gòu)成一定大小的孔洞，在反應(yīng)液中加入這種特殊顆粒的混懸液時(shí)，小分子的游離抗原被活性炭吸附，達(dá)到分離B與F的目的。

　　活性炭吸附方法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便、價(jià)廉，缺點(diǎn)是離心沉淀部分是F而不是B，不適用目前自動(dòng)化放免測(cè)定，分離時(shí)易受溫度和時(shí)間的影響。

　�。ǘ�）沉淀分離法

　　沉淀分離法的原理，是鹽類(lèi)或有機(jī)溶劑能夠破壞蛋白質(zhì)分子表面的水化層而發(fā)生沉淀（這種分離要求蛋白質(zhì)分子處在等電點(diǎn)環(huán)境中）。常用的沉淀劑是聚乙二醇（PEG）。PEG是一種直鏈大分子聚合物，使用PEG溶液時(shí)分離沉淀是在有載體血清蛋白或丙種蛋白存在，而且要求γ球蛋白的*終濃度達(dá)250mg/ml以上的情況下才能實(shí)現(xiàn)。PEG沉淀的結(jié)果易受過(guò)量的脂類(lèi)或離心溫度的變化影響，PEG離心溫度在20^℃以下進(jìn)行。PEG沉淀的優(yōu)點(diǎn)是PEG價(jià)格低廉，操作簡(jiǎn)便，一次可處理大量樣品。其缺點(diǎn)是PEG單獨(dú)使用時(shí)非特異結(jié)合高，所以常與其它方法聯(lián)合使用；其分離效果易受pH、溫度等影響。

　�。ㄈ�）雙抗體分離法

　　雙抗體分離法也稱(chēng)免疫分離法，是特異性分離，應(yīng)用十分普遍。本法是以抗IgG抗體和可溶性的抗原-抗體復(fù)合物結(jié)合，形成很大的復(fù)合物而沉淀。很多抗原的特異抗體來(lái)自家兔或豚鼠，稱(chēng)為抗體，形成的復(fù)合物不能通過(guò)離心將其沉淀。或?qū)⒖贵w的同種正常動(dòng)物的血清IgG免疫另一種動(dòng)物所制得的抗體為第二抗體，該抗體與抗體形成不可溶的復(fù)合物，經(jīng)離心可將其沉淀，從而達(dá)到分離的目的。

　　第二抗體分離的優(yōu)點(diǎn)是重復(fù)性好，B和F分離較為完全，非特異結(jié)合低，可同時(shí)處理大量樣品，使用方便。缺點(diǎn)是分離時(shí)間長(zhǎng)，非特異性結(jié)合可有較大的波動(dòng)，第二抗體用量較大。

　�。ㄋ模┐判苑蛛x法

　　1975年，Hersh報(bào)道了用磁化分離技術(shù)分離血清狄高辛放免測(cè)定的B、F后，受到了廣泛的重視。近年來(lái)國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者對(duì)磁化顆粒的制備進(jìn)行了系統(tǒng)地研究，應(yīng)用于B與F的分離，并取得了引人注目的進(jìn)展，使放免的B、F分離不再使用離心，縮短了放免操作時(shí)間，便于放免自動(dòng)化測(cè)量。磁性分離的具體原理為血清樣品與標(biāo)準(zhǔn)品中的抗原與磁顆粒上的一定量的抗體反應(yīng)，產(chǎn)生的抗原抗體磁性顆粒復(fù)合物，在磁場(chǎng)作用下沉降，使結(jié)合部分與游離部分分離。在磁性分離器上棄上清，進(jìn)行測(cè)量。優(yōu)點(diǎn)是簡(jiǎn)化了操作程序，B、F分離也較完全，穩(wěn)定性好。

　　目前常用的磁性分離技術(shù)除磁性固相抗體外，還有磁化活性炭吸附分離劑。

　�。ㄎ澹┕滔喟�被分離法

　　近年來(lái)由于固相技術(shù)的研究使其固相所被（埋）技術(shù)發(fā)展迅速，再有固相包被具有簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定、不需離心等優(yōu)點(diǎn)，有逐漸取代液相法的趨勢(shì)。

　　1990年，Causse報(bào)告了活化塑料管新技術(shù)及生物素結(jié)合抗體、親和素標(biāo)記物的應(yīng)用，使放免技術(shù)對(duì)多數(shù)微量物質(zhì)的檢測(cè)可達(dá)到10^-15g級(jí)水平，大大提高了放免測(cè)定的精確度、靈敏度。

　　抗體包被：物理吸附法—方法簡(jiǎn)便，但包被量低。

　　價(jià)鍵結(jié)合法—需要纖維素、瓊脂等固相載體，操作復(fù)雜。

　　Causse活化塑料管新技術(shù)，提高了包被量，主要特點(diǎn)是將順丁烯二酸酐和苯乙烯的共聚體涂布試管，在試管壁形成一層活性薄膜（這種方法操作簡(jiǎn)便）。

　�。�六）雙抗體+PEG的分離法

　　這種分離方法利用雙抗體特異性強(qiáng)、PEG沉淀簡(jiǎn)便快速的優(yōu)點(diǎn)，從而克服了雙抗體時(shí)間長(zhǎng)、PEG方法非特異結(jié)合高的缺點(diǎn)。這一方面是當(dāng)前分離技術(shù)中較理想的一種方法。

　　這種聯(lián)合方法分離方法減少了第二抗體的用量，PEG的*終濃度也只需2～4%，成本較低。這種方法既適用于蛋白質(zhì)、酶、大分子物質(zhì)，又適用于小分子肽等半抗原物質(zhì)。

　　1991年，北京中國(guó)同位素公司北方免疫試劑所采用80年代法國(guó)廣泛應(yīng)用的雙抗體+PEG、再加一定劑量的γ球蛋白（免疫第二抗體時(shí)應(yīng)用的γ球蛋白）的分離劑，溶解于磷酸緩沖液中，pH在7.4左右。這種分離劑推廣應(yīng)用產(chǎn)生了很好的效果。沉淀完全，牢固，而非特異性結(jié)合低，時(shí)間短（加入分離劑15min后即可離心），受溫度影響小，受到用戶(hù)的廣泛好評(píng)。

　　以上方法，要依據(jù)反應(yīng)液中反應(yīng)物分子量大小，酸堿度等特點(diǎn)，選擇合適的分離方法及分離劑。

第四節(jié)　樣品的前處理

　　樣品的正確收集與處理，是蛋白質(zhì)及多肽激素放射免疫分析取得成功的前提。不同的樣品與測(cè)定項(xiàng)目，其前處理有不同的要求。下面以神經(jīng)肽測(cè)定為例，介紹樣品的前處理方法。

　　一、腦、脊髓與垂體中神經(jīng)肽的提取（以大鼠為例）

　　1．大鼠稱(chēng)重后，在盡量安靜的情況下，迅速斷頭、取軀干血。

　　2．盡快取下全腦、脊髓（某段）與垂體，在沸生理鹽水中煮5min，以滅活酶，保持神經(jīng)肽的穩(wěn)定。

　　3．根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求分出腦區(qū)（如小腦、橋延腦、下丘腦、中腦或中央灰質(zhì)、丘腦、皮層、海馬、紋狀體等與垂體前葉。

　　4．腦區(qū)等稱(chēng)重。

　　5．把腦區(qū)、垂體或脊髓，分別置于玻璃勻漿管內(nèi)，加入1mol/l HAC（或HCl）1ml，充分勻漿后倒入塑料指形管中，在室溫下放置100min，使生物活性物質(zhì)充分溶解在酸中。

　　6．加入1mol/l NaOH 1 ml，中和酸。

　　7．離心，取上清。

　　8．低溫（-20^℃以下）保存待測(cè)。

　　二、大鼠腦神經(jīng)核團(tuán)微穿孔取樣方法（以下丘腦為例）

　　1．大鼠迅速斷頭，取出全腦，置沸生理鹽水中煮5min。

　　2．將全腦置于取材角度器上，分別于視交叉前和乳頭體后用雙面刀片垂直切斷，取下丘腦塊。

　　3．將雙面刀片裝在切片機(jī)上。

　　4．將下丘腦置于切片機(jī)機(jī)載物臺(tái)上，腹側(cè)向下，并用502膠水固定。在腦塊后方適當(dāng)放置瓊脂塊以利固定。

　　5．開(kāi)動(dòng)振動(dòng)切片機(jī)，緩慢移動(dòng)推進(jìn)器，切片厚400～500μm。用毛筆沾生理鹽水，小心收集切片置于平皿內(nèi)的生理鹽水中。

　　6．將腦切片平置于橡皮板上，并在體視顯微鏡下，參照鼠腦立體定位圖譜，確定神經(jīng)核團(tuán)位置。

　　7．選擇相應(yīng)直徑的穿孔器，分別于兩側(cè)核團(tuán)上垂直插下，然后推出針蕊將所取核團(tuán)組織放入勻漿器中。

　　8．加入1mol/l HAC 0.5ml, 充分勻漿后倒入放免測(cè)定管中，放置100min。

　　9．加入1mol/l NaOH 0.5ml中和酸，離心（3000rpm/min）20min，取上清液，低溫保存待測(cè)。

　　三、內(nèi)臟、腫瘤組織中神經(jīng)肽的提�。ㄒ晕刚衬�為例��

　�。�1）取下胃粘膜后，迅速稱(chēng)重置于試管，中沸蒸餾水1ml，在水浴中煮100min。標(biāo)本在室溫下放置，其中的生物活性物質(zhì)會(huì)被酶降解，所以要立即加熱處理。

　�。�2）冷卻后倒入特殊的勻漿器中，充分勻漿（使用電動(dòng)攪拌器）。勻漿液倒入塑料指形管中，再用蒸餾水1ml，沖洗勻漿器，并倒入上述管中。

　　（3）離心，取上清，低溫保存待測(cè)。

　　四、血漿

　　1．直接測(cè)定

　�。�1）加酶抑制劑：準(zhǔn)確采全血若干毫升，注入預(yù)冷的加有①抗凝劑0.3mol/l EDTA·2Na（乙二胺四乙酸二鈉）溶液（每毫升全血20μl）、或1%肝素（每毫升全血10μl）；②抑肽酶（每毫升全血500單位）的塑料指形管中，迅速低溫離心，取血漿低溫保存待測(cè)。

　　抑肽酶有液體的（標(biāo)簽寫(xiě)的有每毫升含多少單位）與固體的（每毫升含12TIU，1TIU=900KIU，即每毫克含10800單位）。固體的抑肽酶可用生理鹽水溶解，使之每20μl含500單位。

　�。�2）酸化處理：每毫升血漿加1mol/l HCl 0.2ml，低溫保存待測(cè)。測(cè)定前加1mol/l NaOH 0.2ml。

　　以上兩種方法，任選一種即可。

　　2．間接測(cè)定血標(biāo)本經(jīng)提取后，可去除蛋白質(zhì)等干擾因素，并使微量的生物活性肽濃縮，但較費(fèi)時(shí)，成本也高。常用的提取方法有：

　�。�1）柱層析提取法：有多種層析柱可供提取不同的神經(jīng)肽，其中較為方便的是用Sep-pak C₁₈層析柱提取。主要步驟步：

　�、僦�的預(yù)處理：該柱有兩頭，長(zhǎng)頭連接注射器，可注入溶液與樣品，短頭為排出口。預(yù)處理時(shí)注入乙腈10ml。蒸餾水20ml，使柱中的生物膠活化。

　　②注入樣品（如血漿、腦脊液、腹水、尿等）：樣品中的水份流出，生物活性肽、蛋白及雜質(zhì)等吸附在生物膠上。血漿上柱前，如先去除蛋白，可增加柱子的使用時(shí)間。]

　�、哿芟矗河�4%HAC溶液100ml注入柱中，以洗去一些雜質(zhì)。

　�、芟疵摚河�7ml酸性乙腈（按容積算，每100ml中含有乙腈75ml、HAC4ml、蒸餾水21ml）作為洗脫劑，注入柱中，把生物活性肽洗脫下來(lái)，收集在塑料指形管中。

　�、萸逑矗河靡译妗⒄麴s水清洗柱子，以備后用。

　�、迣⑾疵撘捍蹈桑�低溫保存待測(cè)。測(cè)定時(shí)可加入一定量的緩沖液溶解。

　　Sep-Pak C₁₈柱層析，也可用于制備標(biāo)記抗原時(shí)的層析純化。

　�。�2）加膜藻土提取法：

　　①抽血：用一次性塑料注射器抽取受試者靜脈血4ml，置于加有肝素（125單位/ml 全血）指形管中。

　�、诜蛛x血漿：在4^℃下離心，取出血漿。

　�、垩獫{酸化：取2ml血漿，加入1mol/l HCl 0.5ml, 搖勻。

　�、芪�附：加��0.5%藻土懸液2ml，在水平震蕩器上震30min。離心，去上清，留沉淀。

　　0．5%藻土縣液（Fuller’s earth）的配制：

　　0.5g Fuller’s earth

　　0.1g Dextran T₇₀

　　100ml去離子水

　�、菹疵摚涸诔恋砉苤屑尤�80%酸性丙酮1ml，在漩渦振蕩器上振2min，離心，取上清置于經(jīng)硅化的玻管中。

　　80%酸性丙酮的配制：

　　80ml丙酮

　　20ml 1mol/L HCl

　　⑥去脂：加入石油醚1ml，搖勻，脂肪溶解在石油醚中，分層后吸去上層。

　�、吒稍铮合聦右后w，置于37℃水浴中，用氮?dú)猓ɑ蚩諝猓┐蹈伞?/p>

　　⑧低溫保存待測(cè)。測(cè)定時(shí)用一定量緩沖液溶解。

　�。�3）有機(jī)溶劑提取法：常用的有甲醇、乙醇、乙腈、丙酮等。將溶劑按一定比例，加入標(biāo)本內(nèi)，混勻、振蕩、離心，取上清吹干，冷藏待測(cè)。通常在有機(jī)溶劑中加入適量的酸。

　　在這些方法中，以柱層析法*穩(wěn)定、準(zhǔn)確，但成本高，推廣不易。加膜藻土法，提取率較高，但操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)。有機(jī)溶劑提取法操作方便，成本也低，雖穩(wěn)定性較差。

　　五、腦脊液

　　1．煮沸收集腦脊液時(shí)，管子浸在冰水中。收集完畢，立即在沸的水浴中煮5min。離心、取上清；低溫保存，待測(cè)。

　　2．酸化在1ml腦脊液中加入1mol/l HCl 0.2ml；測(cè)定時(shí)，再加入1mol/l NaOH 0.2ml中和。

　　3．加酶抑制劑

　　4．柱層析提取

　　以上方法，任選一種。

　　六、尿

　　尿液收集于事先加有適量醋酸或鹽酸的容器中，使pH達(dá)4左右，煮沸1～2min，冷卻后離心，取上清，加適量NaOH液，使尿液pH達(dá)7.0左右。此尿即可用于直接測(cè)定或經(jīng)提取后再測(cè)定。

　　尿認(rèn)提取法相同。采用Sep—Pak C₁₈柱層析提取較為方便，因尿中不含蛋白，柱子可多次使用。

　　七、胃液

　　抽取胃液，注入加有抑肽酶的管中，離心，取上清，低溫保存待測(cè)。

第五節(jié)　放射免疫分析法的建立

　　一、放射免疫分析的基本試劑

　�。ㄒ唬���(biāo)準(zhǔn)品

　　標(biāo)準(zhǔn)品是放射免疫分析法定量的依據(jù)，由于以標(biāo)準(zhǔn)品的量用來(lái)表示被涮物質(zhì)的量，故標(biāo)準(zhǔn)品與被測(cè)物質(zhì)應(yīng)當(dāng)化學(xué)結(jié)構(gòu)一致并具有相同免疫活性。標(biāo)準(zhǔn)品作為定量的基準(zhǔn)。應(yīng)要求高度純化。標(biāo)準(zhǔn)品除含量應(yīng)具有準(zhǔn)確性外，還應(yīng)具備穩(wěn)定性，即在合理的貯存條件下保持原來(lái)的特性。

　　按實(shí)驗(yàn)要求，將標(biāo)準(zhǔn)品用緩沖液配成含不同劑量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用于制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

　�。ǘ�）��(biāo)記物

　　標(biāo)記抗原應(yīng)具備：①比放射性高，以保證方法的靈敏度；②免疫活性好；③所用的核素的半衰期盡可能長(zhǎng)，標(biāo)記一次可較長(zhǎng)時(shí)間使用，這對(duì)來(lái)之不易的抗原尤其重要；④標(biāo)記簡(jiǎn)便、易防護(hù)。

　　要準(zhǔn)確測(cè)量B與F的放射性，必須有足夠的放射性強(qiáng)度。所選用的標(biāo)記抗原的量，在使用¹²⁵I時(shí)達(dá)5000～15000cpm。

　�。ㄈ�）抗體

　　應(yīng)選擇特異性高、親和力強(qiáng)及滴度好的抗體，用于放射免疫測(cè)定。

　　根據(jù)稀釋曲線(xiàn)，選擇適當(dāng)?shù)南♂尪龋�一般以結(jié)合率為50%作為抗血清的稀釋度。

　　（四）B與F分離劑

　　以2%加膜活性炭溶液為例，2%加膜活性炭溶液的配制：

　　活性炭2g（杭州木材廠(chǎng)生產(chǎn)，森工牌732型）

　　右旋糖酐T₂₀0.2g

　　加0.1mol/L PB 至100ml

　　電磁攪拌1h，然后置于變通冰箱冰箱待用。

　�。ㄎ澹┚彌_液

　　放射免疫分析技術(shù)所用的緩沖液有多種，要通過(guò)實(shí)驗(yàn)選用抗體和抗原結(jié)合的緩沖液。

　　目前*常用的緩沖液有下列幾種：①磷酸鹽緩沖液；②醋酸鹽緩沖液；③巴比妥緩沖液；④Tris –HCl緩沖液；⑤硼酸緩沖淮。其中以磷酸鹽緩沖液應(yīng)用*多。

　　在緩沖液中，除必須有弱酸及弱酸的鹽成分外，還應(yīng)根據(jù)不同檢測(cè)項(xiàng)目加入下列物質(zhì)：①保護(hù)蛋白：常用的有牛血清白蛋白或白明膠，濃度為0.1%～0.2%，用以降低試管對(duì)抗原的非特異性吸附。②防腐劑：多采用0.1%疊氮鈉、0.01%柳硫汞、溶菌酶或抗菌素。③酶抑制劑：如測(cè)定心鈉素等肽類(lèi)激素時(shí)，要加入適量的抑肽酶，用以抑制血漿內(nèi)源性水解酶對(duì)待測(cè)物的降解；又如測(cè)定cAMP、cGMP時(shí)，需加入EDTA·2Na，抑制磷酸二酯酶的活性。④阻斷劑：在測(cè)定甲狀腺激素或測(cè)定某些甾體激素時(shí)，必須加阻斷劑，使和蛋白質(zhì)相結(jié)合的激素，變?yōu)橛坞x型。常用的阻斷劑有8—苯胺—1—萘磺酸、柳硫汞、水楊酸鈉、三氯醋酸鈉等。⑤載體蛋白：采用二抗作B與F分離劑時(shí)，要向反應(yīng)液中加入適量與抗體同種動(dòng)物的正常血清。在測(cè)定不含有血漿蛋白的樣品時(shí)，用PEG沉淀劑分離B、F，必須加適量γ球蛋白或正常人混合血清。

　　在神經(jīng)肽的RIA時(shí)，常用PELH緩沖液，（按1000ml,pH7.6）：

　　0．1mol/l PB　　　　　　　　980.0ml

　　0.3mol/L EDTA·2Na　　　　　10.0ml

　　0.2%洗必泰溶液　　　　　　　10.0ml

　　溶菌酶　　　　　　　　　　　1.0g

　　二、加樣程序

　　由于抗原、標(biāo)記抗原和抗體三者加樣次序不同，而出現(xiàn)兩種加樣程序，分述如下：

　�。ㄒ唬┢胶怙柡图訕映绦�

　　1．基本原理所謂平衡飽和，是指抗原和抗體反應(yīng)達(dá)到再不結(jié)合，也不解離的平衡狀態(tài)，稱(chēng)為飽和狀態(tài)，即平衡飽和。所以，有人稱(chēng)此為飽和分析法。這意味著抗原或被測(cè)抗原、標(biāo)記抗原、抗體三者一起溫育。

　　2．加樣程序一般先加標(biāo)準(zhǔn)物或被測(cè)樣品，再加抗血清，*后加標(biāo)記物。這樣的順序是讓標(biāo)準(zhǔn)物或被測(cè)物與抗體有短暫的結(jié)合，提高抗原的競(jìng)爭(zhēng)抑制能力。

　　在小分子半抗原的放射免疫分析中，標(biāo)記抗原和未標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合的親合力常常是不相同的，前者比后者的親合力高。因此，上述加樣程序就更有必要，所以一般都采用先加標(biāo)準(zhǔn)物或樣品和抗血清，后加標(biāo)記物。這樣測(cè)定也比較穩(wěn)定。

　　在大分子蛋白質(zhì)抗原的放射免疫分析中，如果是雙抗體分離法，抗原和標(biāo)記抗原與抗體三者加樣，可不分先后，有的是標(biāo)準(zhǔn)物、標(biāo)記物、抗血清的加樣順序，但一般習(xí)慣還是標(biāo)準(zhǔn)物或血樣、抗血清、標(biāo)記物、然后混勻溫育24～48h，再加雙抗體，繼續(xù)溫育24h，使免疫反應(yīng)達(dá)到平衡。對(duì)一些多肽激素的放射免疫分析，應(yīng)用雙抗體分離法，其流程比較長(zhǎng)，這樣的順序同樣可不分先后。

　　以大鼠垂體、下丘腦β-內(nèi)啡肽RIA測(cè)定程序?yàn)槔��?/p>

　　（1）加樣（單位μl；總反應(yīng)體積500μl）

　�。�2）孵育：4℃，24h

　　（3）分離B與F：每管加入2%加膜活性炭溶液300μl，搖勻，立即離心，去上清，測(cè)沉淀（F）的CPM數(shù)。

　�。ǘ�）順序飽和加樣程��

　　1．基本原理先將標(biāo)準(zhǔn)物或血樣品與抗血清混勻，免疫反應(yīng)6～24h，使抗原與抗體充分結(jié)合，甚至達(dá)到平衡，然后再加入標(biāo)記抗原，與抗體反應(yīng)12～24h，*后分離B與F，這稱(chēng)為順序飽和分析法。

　　應(yīng)用順序飽和加樣，可以提高測(cè)定方法的靈敏度。Utiger在做人促甲狀腺激素（TSH）放射免疫分析時(shí)，將標(biāo)記物延至第2天加入，發(fā)現(xiàn)其靈敏度增加兩倍。如果縮短*后的溫育時(shí)間，仍可取得滿(mǎn)意的結(jié)果。所以一般認(rèn)為，在順序飽和加樣中，第1次溫育時(shí)間可以長(zhǎng)，而第2次溫育時(shí)間要短，這樣可以提高靈敏度。但也有相反的意見(jiàn)，認(rèn)為順序飽和加樣，是使用過(guò)量抗體，會(huì)使靈敏度受到一定影響。如果使用抗體不過(guò)量，溫育時(shí)間縮短，在抗原和抗體結(jié)合未達(dá)到平衡飽和時(shí)就加入標(biāo)記物，這樣既不影響加靈敏度，反而比較穩(wěn)定，甚至可提高靈敏度。

　　2．加樣程序　以人血漿精氨酸加壓素RIA測(cè)定程序?yàn)槔�（直接測(cè)定）。

　�。�1）加樣（單位μl；總反應(yīng)體積600μl）

　�。�2）孵育：4^℃，24h。

　　（3）分離B與F。

　　無(wú)肽血漿，用于血漿的直接測(cè)定。其制備方法為：在電磁攪拌下，抽取2%加膜活性炭溶液5ml，共兩管，離心、去上清。血漿5ml，倒入上述活性炭管中，加蓋，充分振蕩10min，離心，上清倒入上述另一活性炭管中，振蕩10min，再離心，取上清，即無(wú)肽血漿。血漿中的生物活性物質(zhì)被活性炭吸附而去除。

　�。ㄈ�）��(jì)數(shù)、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)與測(cè)定樣品含量

　　以活性炭分離B與F，沉淀計(jì)數(shù)是F的cpm。T—F—NSB，得B的cpm數(shù)。

　　計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)管與樣品管結(jié)合（B）的cpm數(shù)及與零標(biāo)準(zhǔn)管結(jié)合（B₀）的比（B/B₀×100%）。

　　用半對(duì)數(shù)紙，以標(biāo)準(zhǔn)管的B/B₀為縱座標(biāo)，以各標(biāo)準(zhǔn)管含量為橫座標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

　　根據(jù)樣品的結(jié)合率（B/B₀×100%），從標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)中找出被測(cè)樣品抗原的含量，再換算成每毫升血漿含某抗原的量，或每毫克（組織濕重）含某抗原的量。

　　三、放射免疫分析的質(zhì)量控制

　�。ㄒ唬┵|(zhì)量控制的目的和內(nèi)容

　　放射免疫分析的質(zhì)量控制實(shí)際上就是控制測(cè)定誤差，監(jiān)督測(cè)定結(jié)果。它包括兩方面的內(nèi)容：一方面對(duì)測(cè)定結(jié)果做精確分析；另一方面鑒定常規(guī)測(cè)定方法，對(duì)那些測(cè)定結(jié)果不好的方法加以改進(jìn)，并建立新的測(cè)定方法。質(zhì)量控制分四個(gè)方面：

　　1．在一個(gè)測(cè)定方法內(nèi)產(chǎn)生的誤差。

　　2．在同一實(shí)驗(yàn)室內(nèi)不同方法之間產(chǎn)生的誤差。

　　這兩種情況屬于內(nèi)部質(zhì)量控制。

　　3．用同一測(cè)定方法，在各實(shí)驗(yàn)室之間產(chǎn)生的誤差。

　　4．采用不同方法，在各實(shí)驗(yàn)室之間產(chǎn)生的誤差。

　　后兩種情況屬于外部質(zhì)量控制。

　�。ǘ�）放射免疫分析中造成測(cè)量誤差的因素

　　誤差包括系統(tǒng)誤差和隨機(jī)誤差。系統(tǒng)誤差發(fā)生在測(cè)量過(guò)程中由于儀器不準(zhǔn)、試劑不純、標(biāo)準(zhǔn)品不穩(wěn)定等原因，使測(cè)定結(jié)果呈傾向性偏大或偏小，這種誤差應(yīng)力求避免。隨機(jī)誤差是測(cè)量過(guò)程中各種偶然因素造成的，沒(méi)有固定的傾向性，這類(lèi)誤差是不可避免的，必要時(shí)做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

　　造成誤差的可能來(lái)源有以下幾個(gè)方面：

　　1．各種儀器：設(shè)備的準(zhǔn)確性、穩(wěn)定性、效率以及被污染等情況帶來(lái)的誤差。如：①由于放射性測(cè)量?jī)x器的穩(wěn)定性、效率、樣品試管的材料和均勻性及被測(cè)物的放射性強(qiáng)度等原因。②由于樣品的自吸收，本底校正，測(cè)定時(shí)間，可能的污染等原因。③在試驗(yàn)室中所有的移液管、微量取樣器以及天平的刻度、校準(zhǔn)和使用方法等原因。④由于反應(yīng)試管、移液管以及測(cè)定用試管等表面清潔度和所引起的不同吸附等原因都可以對(duì)測(cè)定結(jié)果帶來(lái)誤差。

　　2．試劑的純度、質(zhì)量和穩(wěn)定性的影響也是造成誤差的重要因素。如標(biāo)記抗原的比度、純度，輻射自分解，抗體的穩(wěn)定性，分離劑、阻斷劑及緩沖液等試劑的純度等。

　　3．在放射免疫分析中一些基本操作，如取樣、提取、沉淀、分離以及保溫條件不適當(dāng)?shù)仍斐傻恼`差。由于工作人員熟練程度不同也常常帶來(lái)誤差，如操作移液管垂直程度、下流速度、吹氣與不吹氣等。工作人員草率、不按規(guī)程操作等也都可以造成誤差。

　　4．樣品誤差。樣品的收集方法、貯存溫度、放置條件，微量樣品取樣的準(zhǔn)確度，樣品可能造成的污染以及樣品的變性（如免疫反應(yīng)活性的降低、蛋白質(zhì)的變性等）也都能造成測(cè)量的誤差。

　　5．提取及層析分離過(guò)程中的丟失。

　�。ㄈ�）放射免疫分析中測(cè)量誤差的控制

　　1．選擇準(zhǔn)確性高的方法：對(duì)各種方法進(jìn)行比較，淘汰粗糙及難以重復(fù)的方法。

　　2．建立方法對(duì)比。用相同的測(cè)量方法和不同的測(cè)量方法在同一實(shí)驗(yàn)室和不同實(shí)驗(yàn)室，在同一地區(qū)和不同地區(qū)，在同一時(shí)間和不同時(shí)間，對(duì)同一樣品進(jìn)行對(duì)比，檢查產(chǎn)生誤差的原因。

　　3．建立各種類(lèi)型的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)規(guī)定純度及制備方法，使用年限及貯存條件。

　　4．建立操作規(guī)程，按章　操作。對(duì)使用的試劑、儀器設(shè)備要經(jīng)常檢查其有效性，更換試劑時(shí)應(yīng)進(jìn)行必要的鑒定，必要時(shí)對(duì)測(cè)定方法要做重復(fù)性試驗(yàn)和回收試驗(yàn)。

　　5．建立可靠的檢查制度。經(jīng)常對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行核查，利用控制血清、標(biāo)準(zhǔn)血清檢查每批結(jié)果的準(zhǔn)確性