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原代細(xì)胞培養(yǎng)方法

閱讀次數(shù):2584   發(fā)布時(shí)間:2012/10/23 14:14:53

②多次提取消化法多次提取消化法有以下三種:
熱消化多次提�。瓕⒓羲榈募�(xì)胞塊加入0.25%胰蛋白酶37℃水浴中消化15~20分鐘,然后經(jīng)洗滌后用營(yíng)養(yǎng)液分散制成細(xì)胞懸液,按合適的濃度分瓶培養(yǎng),然后將留下的未徹底消化的組織按上述方法操作,再消化提取細(xì)胞。
冷消化多次提�。椒ㄍ�,只是消化溫度為4℃。
先熱消化后冷消化--將組織塊先用胰蛋白酶于37℃下消化20分鐘經(jīng)洗滌后用營(yíng)養(yǎng)液分散,制成懸液,剩余未消化的小組織塊經(jīng)洗滌后用胰酶于4℃下過(guò)夜,次日再提取細(xì)胞,分散成懸液,分瓶培養(yǎng)。
(2) 膠原酶(Collagenase)消化法
膠原酶是一種從細(xì)菌中提取出來(lái)的酶,對(duì)膠原有很強(qiáng)的消化作用。適于消化纖維性組織、上皮組織以及癌組織,它對(duì)細(xì)胞間質(zhì)有較好的消化作用,對(duì)細(xì)胞本身影響不大,可使細(xì)胞與膠原成分脫離而不受傷害。該酶分離效果好,即使有鈣、鎂離子存在仍有活性,故可用PBS和含血清的培養(yǎng)液配制,即操作簡(jiǎn)便又可提高細(xì)胞成活率,*終濃度200u/mL或0.1~0.3mg/mL.此酶消化作用緩和,無(wú)需機(jī)械振蕩,但膠原酶價(jià)格較高,大量使用將增加實(shí)驗(yàn)成本。
經(jīng)過(guò)膠原酶消化后的上皮組織,由于上皮細(xì)胞對(duì)酶有耐受性,可能有一些上皮細(xì)胞團(tuán)塊尚未被完全消化開。成小團(tuán)塊的上皮細(xì)胞比分散的單個(gè)上皮細(xì)胞更易生長(zhǎng),因此不必要再進(jìn)一步消化處理。
鑒于胰蛋白酶和膠原酶的生物學(xué)活性(見表4-1)和在不同濃度下消化各種組織小塊所需的時(shí)間(小時(shí))有差異(見表4-2),以及兩者價(jià)格不等,有人采用膠原酶與胰蛋白酶并用,同時(shí)還可加透明質(zhì)酸酶(對(duì)細(xì)胞表面糖基有作用),采用兩者的聯(lián)合消化作用,對(duì)分散大鼠和兔肝、癌組織非常有效。
 
表4-1 胰蛋白酶和膠原酶生物活性的差別
  
項(xiàng) 目
  
  
胰蛋白酶
  
  
膠原酶
  
  
消化特性
  
  
適用于消化軟組織
  
  
適用于消化纖維多的組織
  
  
用 量
  
  
0.01%~0.5%
  
  
0.1~0.3mg/mL(200u/mL)
  
  
消化時(shí)間
  
  
0.5~2小時(shí)(小塊)
  
  
1~12小時(shí)
  
  
pH
  
  
8~9
  
  
6.5~7.0
  
  
作用強(qiáng)度
  
  
強(qiáng)烈
  
  
緩和
  
  
細(xì)胞影響
  
  
時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有影響
  
  
無(wú)大影響
  
  
血清、鈣、鎂離子
  
  
有影響
  
  
無(wú)影響
  
表4-2 胰蛋白酶和膠原酶在不同溫度下消化各種組織小塊時(shí)所需時(shí)間(小時(shí))(0.5~1cm3)
  
酶 種 類
  
  
較 硬 組 織
  
  
軟 組 織
  
  
4℃ 室 溫 37℃
  
  
4℃  室 溫 37℃
  
  
胰蛋白酶(0.25%)
  
  
24~48
  
  
1~6
  
  
1~2
  
  
12~24
  
  
1~2
  
  
0.5~1
  
  
膠原酶(200u/mL)
  
  
24
  
  
6
  
  
6.5
  
  
12
  
  
3
  
  
0.25
  
  
兩者聯(lián)合(對(duì)沖)
  
  
12~46
  
  
12~24
  
  
4~12
  
  
12~24
  
  
6~12
  
  
1~2
  
除上述兩種*常用的消化酶外,還有鏈霉蛋白酶、粘蛋白酶、蝸牛酶、彈性蛋白酶、木瓜蛋白酶,近年來(lái),還有一種從灰霉菌中提取的Pronase新酶分散細(xì)胞更佳。
2、非酶消化法(EDTA消化法)
EDTA是一種非酶消化物,又稱螯合劑或Versene,全名為乙二胺四乙酸。常用不含鈣、鎂離子的PBS配成0.02%的工作液,對(duì)一些組織,尤其是上皮組織分散效果好,該化學(xué)物質(zhì)能與細(xì)胞上的鈣、鎂離子結(jié)合形成螯合物,利用結(jié)合后的機(jī)械力使細(xì)胞變圓而分散細(xì)胞或使貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離,缺點(diǎn)是細(xì)胞易裂解或貼壁細(xì)胞從瓶壁上脫離時(shí)呈片狀,有團(tuán)塊,常不單獨(dú)使用,但可與胰蛋白酶混合使用(1:1或2:1),不僅利于細(xì)胞脫壁又利于細(xì)胞分散,可降低胰酶的用量和毒性作用。
消化分離法的操作步驟:
(1)剪切 把組織塊剪碎,呈1~5mm3大小的組織塊。
(2) 加液漂洗 將碎組織塊在平皿(或三角燒瓶)中用無(wú)鈣鎂PBS洗2-3次(采用傾斜,自然沉降法)。
(3)消化 加入消化液(胰蛋白酶或膠原酶或EDTA)于37℃水浴中作用適當(dāng)時(shí)間(中間可輕搖1~2次),若組織塊膨松呈絮狀可終止,若變化不大可更換一次消化液,繼續(xù)消化直至膨松絮狀為止。胰蛋白酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)。
(4)棄去消化液 采用傾斜自然沉降或低速離心法盡量棄去消化液。
(5)漂洗 將含有鈣、鎂離子的培養(yǎng)基沿瓶壁緩緩加入,中止消化反應(yīng),采用漂洗法洗2-3次后,加入完全培養(yǎng)基。
(6)機(jī)械分散 采用吸管吹打或振蕩法,使細(xì)胞充分散開后用紗網(wǎng)或3~4層無(wú)菌紗布過(guò)濾后分瓶培養(yǎng),若要求不高可采用傾斜自然沉降5~10分鐘,吸上層細(xì)胞懸液進(jìn)行分瓶培養(yǎng)。
注意事項(xiàng)如下:
(1)組織塊必須漂洗2-3次以除去組織中的鈣、鎂離子和血清對(duì)胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。
(2)胰蛋白濃度不宜過(guò)高,作用時(shí)間不能太長(zhǎng),以避免毒性作用。
(3)消化后組織不僅要盡量棄去消化液,以避免毒性產(chǎn)生,而且動(dòng)作要輕,以避免膨松的細(xì)胞隨漂洗而丟失。
三、原代細(xì)胞的培養(yǎng)方法
 
原代細(xì)胞的培養(yǎng)也叫初代培養(yǎng) 是從供體取得組織細(xì)胞在體外進(jìn)行的首次培養(yǎng),是建立細(xì)胞系的步,是一項(xiàng)基本技術(shù)。原代細(xì)胞因剛從組織中分離開,生物學(xué)特性未發(fā)生很大變化,仍保留原來(lái)的遺傳特性,也*接近和反映體內(nèi)生長(zhǎng)特性,適宜用于藥物敏感性試驗(yàn)、細(xì)胞分化等實(shí)驗(yàn)研究。
 
原代細(xì)胞往往有多種細(xì)胞組成,比較混雜,即使從形態(tài)上為同一類型(上皮樣或成纖維樣),但細(xì)胞間仍有很大差異。如果供體不同,即使組織類型、部位相同,個(gè)體差異也照樣存在,原代細(xì)胞生物特性尚不穩(wěn)定,如需做較為嚴(yán)格的對(duì)比性實(shí)驗(yàn)研究,還需進(jìn)行短期傳代培養(yǎng)。
 
1、組織塊培養(yǎng)法
 
組織塊培養(yǎng)是常用、簡(jiǎn)便易行和成功率較高的原代培養(yǎng)方法,也是早期采用培養(yǎng)細(xì)胞的方法,故原先被稱為組織培養(yǎng)。其方法:為將剪成的小組織團(tuán)塊接種于培養(yǎng)瓶(或皿)中,瓶壁可預(yù)先涂以膠原薄層,以利于組織塊粘著于瓶壁,使周邊細(xì)胞能沿瓶壁向外生長(zhǎng),方法簡(jiǎn)便,利于培養(yǎng),部分種類的組織細(xì)胞在小塊貼壁24小時(shí)后細(xì)胞就從組織塊四周游出,然后逐漸延伸,長(zhǎng)成肉眼可以觀察到的生長(zhǎng)暈,5~7天后組織塊中央的組織細(xì)胞逐漸壞死脫落和發(fā)生漂浮,此漂浮小塊可隨換液而棄去,由組織塊周圍延伸的貼壁細(xì)胞也逐漸形成層片,可在顯微鏡下觀察形態(tài)和用于實(shí)驗(yàn)研究。
 
其培養(yǎng)方法如下:
 
(1)按照前述方法取材,將組織剪成或切成1mm3大小的小塊,并加入少許培養(yǎng)基使組織濕潤(rùn)。
 
(2)將小塊均勻涂布于瓶壁,每小塊間距0.2 cm~0.5cm,一般在25mL培養(yǎng)瓶(底面積為17.5cm2)可接種20~30小塊為宜,小塊放置后,輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶,使瓶底朝上,然后于瓶?jī)?nèi)加入適量培養(yǎng)基蓋好瓶塞,將瓶?jī)A斜放置在37℃溫箱內(nèi)。
 
(3)培養(yǎng)2~4小時(shí),待小塊貼附后,將培養(yǎng)瓶緩慢翻轉(zhuǎn)平放,靜置培養(yǎng),動(dòng)作要輕,嚴(yán)禁搖動(dòng)和來(lái)回振蕩,以防由于沖動(dòng)而使小塊漂起而造成培養(yǎng)失敗,若組織塊不易貼壁可預(yù)先在瓶壁涂一薄層血清、胎汁或鼠尾膠原等。開始培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)基不宜多,以保持組織塊濕潤(rùn)即可,培養(yǎng)24小時(shí)后再補(bǔ)液,培養(yǎng)初期移動(dòng)和觀察時(shí)要輕拿輕放,開始幾天盡量不去搬動(dòng),以利貼壁和生長(zhǎng),培養(yǎng)3~5天時(shí)可換液,一方面補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng),一方面去除代謝產(chǎn)物和漂浮小塊所產(chǎn)生的毒性作用。
 
原代細(xì)胞培養(yǎng)-2
 
2、消化培養(yǎng)法
 
該方法是采用前述的消化分散法,將妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)(包括基質(zhì)、纖維等)去除,使細(xì)胞分散形成細(xì)胞懸液,然后分瓶培養(yǎng)。
 
某些特殊類型細(xì)胞,如內(nèi)皮細(xì)胞、骨細(xì)胞等的消化手段和步驟,將在有關(guān)章節(jié)中敘述。
 
3、懸浮細(xì)胞培養(yǎng)法
 
對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞,如白血病細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、胸水和腹水中的癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞無(wú)需消化,可采用低速離心分離,直接培養(yǎng),或經(jīng)淋巴細(xì)胞分層液分離后接種培養(yǎng)。
 
4、器官培養(yǎng)
 
器官培養(yǎng)是指從供體取得器官或組織塊后,不進(jìn)行組織分離而直接在體外的特定環(huán)境條件下培養(yǎng),其特性仍保持原有器官細(xì)胞的組織結(jié)構(gòu)和聯(lián)系、并能存活,器官培養(yǎng)的目的和技術(shù)均與單層細(xì)胞培養(yǎng)不同,但可利用器官培養(yǎng)對(duì)器官組織的生長(zhǎng)變化進(jìn)行體外觀察。并觀察不同培養(yǎng)條件研究對(duì)器官組織的影響。器官培養(yǎng)可保持器官組織的相對(duì)完整性,可用于重點(diǎn)觀察細(xì)胞間的聯(lián)系、排列情況和相互影響,以及局部環(huán)境的生物調(diào)節(jié)作用。體外器官培養(yǎng)為臨床上的器官移植創(chuàng)造了便利的條件。器官培養(yǎng)的條件與細(xì)胞培養(yǎng)不同,要有特殊的要求。
 
1、器官培養(yǎng)的特殊的要求
 
(1)需要特殊的培養(yǎng)條件 因器官離體培養(yǎng),其營(yíng)養(yǎng)和氧氣僅靠自然滲透來(lái)供給,因此,培養(yǎng)時(shí)為了確保中心不發(fā)生缺乏氧和營(yíng)養(yǎng)而造成壞死,其厚度或直徑不宜超過(guò)1mm.
 
(2)器官內(nèi)部細(xì)胞需要有足夠的氧氣滲入 常采用以下兩種方法:
 
a. 將器官組織塊置于培養(yǎng)基氣液面以利于氣體交換。
 
b. 提高培養(yǎng)基中的氧分壓,一般需加注純氧,提高氧分壓時(shí)仍需保持5% CO2,以維持pH.
 
2、器官培養(yǎng)的方法
 
(1)將不銹鋼網(wǎng)做成的支架,放置于培養(yǎng)皿中,高度為1/2皿高,使其表面鋪上0.5mm孔徑的濾膜。
 
(2)將培養(yǎng)基加入平皿中,使培養(yǎng)液剛剛接觸到濾膜,但不要使濾膜浮起。
 
(3)將要培養(yǎng)的器官組織平放在濾膜上,一般厚度不要超過(guò)200μm,水平面積不超過(guò)10mm2,如為肝、腎不能大于1mm2.
 
(4)將培養(yǎng)物置于CO2培養(yǎng)箱內(nèi),并加注氧氣,調(diào)整氧分壓達(dá)90%,培養(yǎng)時(shí)注意使液面與膜保持在一致的水平上。
 
(5)上述器官培養(yǎng)1~3周(每隔2~3天換液一次)后可用于實(shí)驗(yàn)和檢測(cè)。


 

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