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恒遠(yuǎn):使用ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統(tǒng)

閱讀次數(shù):2083   發(fā)布時(shí)間:2012/9/6 8:59:12

 

使用ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統(tǒng)
分析抗體-膜結(jié)合蛋白以及蛋白-脂類物質(zhì)間的相互作用
介紹:
研究細(xì)胞膜、膜結(jié)合蛋白和抗體間的相互作用以及這些作用的互相影響是藥物研發(fā)中非常值得關(guān)注的事情。膜蛋白和膜相關(guān)蛋白以及多肽類物質(zhì)在很多生物過(guò)程中的地位都非常重要,同時(shí)還參與到一些諸如癌癥等疾病的關(guān)鍵信號(hào)通路中。因此,膜蛋白正迅速成為下一代藥物靶點(diǎn)分子大類。
ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統(tǒng)基于表面等離子體共振(SPR)技術(shù),可同步測(cè)定36種生物分子間的相互作用。本文就是利用其研究人工膜和兩種重要的多肽。Amyloid beta (A)肽在阿爾茨海默病的病理改變中起重要作用,而-synuclein肽則存在于帕金森病的病理變化中。通過(guò)一張修飾過(guò)的ProteOn傳感芯片,我們將Ab與人工膜的結(jié)合動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)給測(cè)定出來(lái)。我們還描述了如何使用ProteOn NLC芯片來(lái)捕獲生物素標(biāo)記的和非生物素標(biāo)記的膜蛋白脂質(zhì)體,并展示了嵌入脂膜中的蛋白和各自抗體的,呈明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系的相互作用曲線。
1. ProteOn XPR36 系統(tǒng)配基-分析物結(jié)合分析的6 × 6陣列格式。A) 6個(gè)ligand 被偶聯(lián)到6條平行的縱向通道中(藍(lán)色);B) 6個(gè)analyte注入到6條與之前相垂直的通道中(黃色);C) 單個(gè)ligand–analyte互作位點(diǎn)綠色區(qū)域以及2個(gè)位點(diǎn)間參照(黃色)。
實(shí)驗(yàn)1. 使用單層小泡(SUVs)對(duì)GLM芯片進(jìn)行修飾并捕獲A和-Synuclein多肽
芯片修飾
傳感芯片表面用50 mM NaOH和8 mM CHAPS分別在橫向和縱向兩個(gè)方向沖洗兩遍,然后縱向連續(xù)注入3針PBS,流速設(shè)為100 µl/min。通道1、3和5用0.05 M sulfo-NHS和0.02 M EDAC活化,條件為30 µl/min,6分鐘。將5 µl Undecylamine(十一胺)和495 l DMSO(二甲基亞砜)混合后用pH 5.0的醋酸鈉溶液稀釋20倍。混合液用移液器吹打混勻,直至澄清。Undecylamine (0.05% v/v) 以30µl/min,注入到通道1、3和5,持續(xù)6分鐘。*后將通道1、3和5用1M 鹽酸乙醇胺去活化,條件是30 µl/min,6分鐘。隨后芯片表面用50 mM NaOH縱向流過(guò)芯片以穩(wěn)定基線。
脂質(zhì)捕獲
單層小泡(SUV)的制備是參照前人文獻(xiàn) (Smith et al., 2008),然后用PBS稀釋到終濃度0.4 mM。SUV在30 µl/min的流速下縱向注入芯片400s。1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- [phospho-L-choline] (POPC) (0.4 mg/ml)注入通道1和2。1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero- 3-[phospho-L-serine] (POPS)注入通道3和4。通道5和6流過(guò)POPC和POPS的混合物。
Analyte注入
A 蛋白(100 µg)按照已有文獻(xiàn)的描述的制備成終濃度22 µM的PBS溶液。芯片表面用PBS以100 µl/min橫向注入30秒沖洗。沖洗3-4次后A (8.8 µM)或-synuclein (7 µM)以100 µl/min橫向注入,結(jié)合1分鐘,解離10分鐘。測(cè)定動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)時(shí),A蛋白以一系列濃度 (11 µM, 5.5 µM, 2.75 µM, and 1.375 µM) 注入4個(gè)通道,僅留一個(gè)通道注入緩沖液。
芯片表面再生
芯片再生需要去掉脂質(zhì),用50 mM NaOH和8mM CHAPS依次注入芯片,采用短時(shí)脈沖形式,即100 µl/min的流速,18秒。
2. 將特定的脂質(zhì) POPC, POPS, POPC/POPS 捕獲在Undecylamine處理過(guò)的GLM 傳感芯片表面。
3. A 蛋白有選擇性地結(jié)合到用Undecylamine 處理過(guò),并偶聯(lián)了脂質(zhì)POPC, POPS, or POPC/POPS的通道中;A 蛋白不會(huì)被捕獲到未經(jīng)處理的芯片表面。
4. -synuclein蛋白有選擇性地結(jié)合到用Undecylamine 處理過(guò),并偶聯(lián)了脂質(zhì)POPC, POPS, or POPC/POPS的通道中;-synuclein不會(huì)被捕獲到未經(jīng)處理的芯片表面。
5. A蛋白和OPC/POPS處理過(guò)的表面的濃度依賴性結(jié)合曲線。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)自3次結(jié)合實(shí)驗(yàn)的平均值:ka = 8.5 (± 0.3 ) x 103 M-1s-1; kd = 3.3 (± 0.1) x 10-3 s-1; KD = 407 (± 9) nM
6. 芯片再生后,將脂質(zhì)POPC, POPS, POPC/POPS再次捕到undecylamine處理過(guò)的GLM 傳感芯片上。通道1,35的再生用50 mM NaOH8mM CHAPS依次注入。實(shí)線代表次脂質(zhì)捕獲曲線,虛線表示第二次捕獲。點(diǎn)線代表脂質(zhì)注入到未處理過(guò)的芯片通道2,46。
實(shí)驗(yàn)2. 生物素修飾的脂質(zhì)體捕獲到NLC芯片表面            
脂質(zhì)結(jié)合
將含單純皰疹病毒標(biāo)簽的M2肽的低生物素化二肉豆蔻酰磷脂酰(DMPC)膽堿脂質(zhì)體(以色列Weizmann 研究所Shai Arkin 教授惠贈(zèng))用緩沖液(PBS)稀釋2倍,然后以25 l/min流速注入垂直方向的1通道,注入2次,共60 l。作為對(duì)照,將不含HSV-M2肽的生物素化的脂質(zhì)體和非生物素化的脂質(zhì)體分別注入水平方向的2和3通道。
Analyte注入
將120l 333nM的抗HSV抗體以100l /min流速注入水平通道。
再生
以100l /min流速注入20mM CHAPS,注入1.2分鐘去除脂質(zhì)體和抗體。后續(xù)分析實(shí)驗(yàn)可重新偶聯(lián)脂質(zhì)體和抗體。
7. 生物素化脂質(zhì)體捕獲到NLC芯片表面。通道1(藍(lán)色曲線),整合HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體;通道2(粉色曲線),不含HSV-M2肽的非生物素化脂質(zhì)體(無(wú)結(jié)合);通道3(淺藍(lán)色曲線),不含HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體(無(wú)結(jié)合)。
8 捕獲到NLC芯片表面的含HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體與抗HSV抗體的相互作用。左圖,通道中抗HSV抗體與脂質(zhì)體結(jié)合的原始圖線。通道1(藍(lán)色曲線),整合HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體;通道2(粉色曲線),不含HSV-M2肽的非生物素化脂質(zhì)體(無(wú)結(jié)合);通道3(淺藍(lán)色曲線),不含HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體(無(wú)結(jié)合)。右圖,抗HSV抗體與整合HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體的特異性反應(yīng)(以通道2為參照通道)。
9. 脂質(zhì)體再生和重新捕獲。
實(shí)驗(yàn)3. 在修飾過(guò)的NLC芯片表面捕獲非生物素化的脂質(zhì)體
脂質(zhì)的結(jié)合
為了避免使用囊泡,將生物素化的雙棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)加入到含有10% DMSO的運(yùn)行緩沖液中,在垂直方向上以25 l/min的流速注射180 l到通道1和通道2,將含有HSV-M2多肽的非生物素化的脂質(zhì)體以25 l/min的流速注射100 l到通道1,通道2作為空白參照。
Analyte的注入
抗HSV的抗體分別以10, 5, 和2.5 nM三個(gè)濃度,100 μl/min的流速,水平注射250μl。
再生
將20 mM Tween 20或20 mM CHAPS以25 μl/min的流速注射30 μl可以除去脂質(zhì)體和抗體。再生后,按照上述方法重復(fù)注射過(guò)程,可將脂質(zhì)體重新捕獲到NLC芯片表面。
10. HSV的抗體(10, 5, 2.5 nM)與嵌入到NLC芯片表面脂質(zhì)體中的HSV-M2多肽的相互作用。
結(jié)論
    ProteOn XPR36蛋白相互作用系統(tǒng)提供了操作簡(jiǎn)便、低成本的方法,便于研究膜-蛋白之間和膜蛋白-抗體之間的相互作用。
    這些相互作用能通過(guò)ProteOn 系統(tǒng)的6*6陣列采用高通量的方式進(jìn)行測(cè)定。
    源于 POPC 和 POPS 的單層小泡(SUV)能夠被反復(fù)地捕獲到修飾過(guò)的ProteOn GLC芯片上,Aβ 多肽和 α-synuclein 多肽的結(jié)合程度亦能測(cè)定。
    能測(cè)定Aβ 多肽與芯片上捕獲的POPC/POPS SUV 表面的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。
    含有HSV標(biāo)簽的 M2 多肽的脂質(zhì)體,不管是生物素化與否,都可以反復(fù)結(jié)合到ProteOn NLC芯片上,重復(fù)性很好。
    抗HSV標(biāo)簽的抗體和嵌入到脂質(zhì)體中的M2多肽的相互作用也能被檢測(cè)到。
    ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統(tǒng)是個(gè)強(qiáng)大的工具,可以用于研究膜和膜相關(guān)蛋白、多肽、抗體的相互作用。
參考文獻(xiàn)
Smith DP et al. (2008). Formation of a high affinity lipid-binding intermediate during the early aggregation phase of alpha-synuclein. Biochemistry 47 (5), 1425–1434.
Tew DJ et al. (2008). Stabilization of neurotoxic soluble beta-sheet-rich conformations of the Alzheimer’s disease amyloid-beta peptide. Biophys J 94 (7), 2752–2766.

上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司是國(guó)內(nèi)首批進(jìn)口elisa試劑經(jīng)銷商,主要做的產(chǎn)品有生物試劑,血清,標(biāo)準(zhǔn)品培養(yǎng)基,elisa試劑盒,勁馬公司是國(guó)內(nèi)眾多大型企業(yè)以及醫(yī)院的產(chǎn)品供應(yīng)商,為了迎接中秋和國(guó)慶節(jié),從即日日產(chǎn)品一律八折出售,給購(gòu)買產(chǎn)品的客戶提供免費(fèi)代測(cè)的服務(wù),歡迎前來(lái)購(gòu)買和咨詢。
 
 

使用ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統(tǒng)
分析抗體-膜結(jié)合蛋白以及蛋白-脂類物質(zhì)間的相互作用
介紹:
研究細(xì)胞膜、膜結(jié)合蛋白和抗體間的相互作用以及這些作用的互相影響是藥物研發(fā)中非常值得關(guān)注的事情。膜蛋白和膜相關(guān)蛋白以及多肽類物質(zhì)在很多生物過(guò)程中的地位都非常重要,同時(shí)還參與到一些諸如癌癥等疾病的關(guān)鍵信號(hào)通路中。因此,膜蛋白正迅速成為下一代藥物靶點(diǎn)分子大類。
ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統(tǒng)基于表面等離子體共振(SPR)技術(shù),可同步測(cè)定36種生物分子間的相互作用。本文就是利用其研究人工膜和兩種重要的多肽。Amyloid beta (A)肽在阿爾茨海默病的病理改變中起重要作用,而-synuclein肽則存在于帕金森病的病理變化中。通過(guò)一張修飾過(guò)的ProteOn傳感芯片,我們將Ab與人工膜的結(jié)合動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)給測(cè)定出來(lái)。我們還描述了如何使用ProteOn NLC芯片來(lái)捕獲生物素標(biāo)記的和非生物素標(biāo)記的膜蛋白脂質(zhì)體,并展示了嵌入脂膜中的蛋白和各自抗體的,呈明顯劑量-效應(yīng)關(guān)系的相互作用曲線。
1. ProteOn XPR36 系統(tǒng)配基-分析物結(jié)合分析的6 × 6陣列格式。A) 6個(gè)ligand 被偶聯(lián)到6條平行的縱向通道中(藍(lán)色);B) 6個(gè)analyte注入到6條與之前相垂直的通道中(黃色);C) 單個(gè)ligand–analyte互作位點(diǎn)綠色區(qū)域以及2個(gè)位點(diǎn)間參照(黃色)。
實(shí)驗(yàn)1. 使用單層小泡(SUVs)對(duì)GLM芯片進(jìn)行修飾并捕獲A和-Synuclein多肽
芯片修飾
傳感芯片表面用50 mM NaOH和8 mM CHAPS分別在橫向和縱向兩個(gè)方向沖洗兩遍,然后縱向連續(xù)注入3針PBS,流速設(shè)為100 µl/min。通道1、3和5用0.05 M sulfo-NHS和0.02 M EDAC活化,條件為30 µl/min,6分鐘。將5 µl Undecylamine(十一胺)和495 l DMSO(二甲基亞砜)混合后用pH 5.0的醋酸鈉溶液稀釋20倍。混合液用移液器吹打混勻,直至澄清。Undecylamine (0.05% v/v) 以30µl/min,注入到通道1、3和5,持續(xù)6分鐘。*后將通道1、3和5用1M 鹽酸乙醇胺去活化,條件是30 µl/min,6分鐘。隨后芯片表面用50 mM NaOH縱向流過(guò)芯片以穩(wěn)定基線。
脂質(zhì)捕獲
單層小泡(SUV)的制備是參照前人文獻(xiàn) (Smith et al., 2008),然后用PBS稀釋到終濃度0.4 mM。SUV在30 µl/min的流速下縱向注入芯片400s。1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3- [phospho-L-choline] (POPC) (0.4 mg/ml)注入通道1和2。1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero- 3-[phospho-L-serine] (POPS)注入通道3和4。通道5和6流過(guò)POPC和POPS的混合物。
Analyte注入
A 蛋白(100 µg)按照已有文獻(xiàn)的描述的制備成終濃度22 µM的PBS溶液。芯片表面用PBS以100 µl/min橫向注入30秒沖洗。沖洗3-4次后A (8.8 µM)或-synuclein (7 µM)以100 µl/min橫向注入,結(jié)合1分鐘,解離10分鐘。測(cè)定動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)時(shí),A蛋白以一系列濃度 (11 µM, 5.5 µM, 2.75 µM, and 1.375 µM) 注入4個(gè)通道,僅留一個(gè)通道注入緩沖液。
芯片表面再生
芯片再生需要去掉脂質(zhì),用50 mM NaOH和8mM CHAPS依次注入芯片,采用短時(shí)脈沖形式,即100 µl/min的流速,18秒。
2. 將特定的脂質(zhì) POPC, POPS, POPC/POPS 捕獲在Undecylamine處理過(guò)的GLM 傳感芯片表面。
3. A 蛋白有選擇性地結(jié)合到用Undecylamine 處理過(guò),并偶聯(lián)了脂質(zhì)POPC, POPS, or POPC/POPS的通道中;A 蛋白不會(huì)被捕獲到未經(jīng)處理的芯片表面。
4. -synuclein蛋白有選擇性地結(jié)合到用Undecylamine 處理過(guò),并偶聯(lián)了脂質(zhì)POPC, POPS, or POPC/POPS的通道中;-synuclein不會(huì)被捕獲到未經(jīng)處理的芯片表面。
5. A蛋白和OPC/POPS處理過(guò)的表面的濃度依賴性結(jié)合曲線。動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)自3次結(jié)合實(shí)驗(yàn)的平均值:ka = 8.5 (± 0.3 ) x 103 M-1s-1; kd = 3.3 (± 0.1) x 10-3 s-1; KD = 407 (± 9) nM。
6. 芯片再生后,將脂質(zhì)POPC, POPS, POPC/POPS再次捕到undecylamine處理過(guò)的GLM 傳感芯片上。通道1,35的再生用50 mM NaOH8mM CHAPS依次注入。實(shí)線代表次脂質(zhì)捕獲曲線,虛線表示第二次捕獲。點(diǎn)線代表脂質(zhì)注入到未處理過(guò)的芯片通道2,46。
實(shí)驗(yàn)2. 生物素修飾的脂質(zhì)體捕獲到NLC芯片表面            
脂質(zhì)結(jié)合
將含單純皰疹病毒標(biāo)簽的M2肽的低生物素化二肉豆蔻酰磷脂酰(DMPC)膽堿脂質(zhì)體(以色列Weizmann 研究所Shai Arkin 教授惠贈(zèng))用緩沖液(PBS)稀釋2倍,然后以25 l/min流速注入垂直方向的1通道,注入2次,共60 l。作為對(duì)照,將不含HSV-M2肽的生物素化的脂質(zhì)體和非生物素化的脂質(zhì)體分別注入水平方向的2和3通道。
Analyte注入
將120l 333nM的抗HSV抗體以100l /min流速注入水平通道。
再生
以100l /min流速注入20mM CHAPS,注入1.2分鐘去除脂質(zhì)體和抗體。后續(xù)分析實(shí)驗(yàn)可重新偶聯(lián)脂質(zhì)體和抗體。
7. 生物素化脂質(zhì)體捕獲到NLC芯片表面。通道1(藍(lán)色曲線),整合HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體;通道2(粉色曲線),不含HSV-M2肽的非生物素化脂質(zhì)體(無(wú)結(jié)合);通道3(淺藍(lán)色曲線),不含HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體(無(wú)結(jié)合)。
8 捕獲到NLC芯片表面的含HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體與抗HSV抗體的相互作用。左圖,通道中抗HSV抗體與脂質(zhì)體結(jié)合的原始圖線。通道1(藍(lán)色曲線),整合HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體;通道2(粉色曲線),不含HSV-M2肽的非生物素化脂質(zhì)體(無(wú)結(jié)合);通道3(淺藍(lán)色曲線),不含HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體(無(wú)結(jié)合)。右圖,抗HSV抗體與整合HSV-M2肽的生物素化脂質(zhì)體的特異性反應(yīng)(以通道2為參照通道)。
9. 脂質(zhì)體再生和重新捕獲。
實(shí)驗(yàn)3. 在修飾過(guò)的NLC芯片表面捕獲非生物素化的脂質(zhì)體
脂質(zhì)的結(jié)合
為了避免使用囊泡,將生物素化的雙棕櫚酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)加入到含有10% DMSO的運(yùn)行緩沖液中,在垂直方向上以25 l/min的流速注射180 l到通道1和通道2,將含有HSV-M2多肽的非生物素化的脂質(zhì)體以25 l/min的流速注射100 l到通道1,通道2作為空白參照。
Analyte的注入
抗HSV的抗體分別以10, 5, 和2.5 nM三個(gè)濃度,100 μl/min的流速,水平注射250μl。
再生
將20 mM Tween 20或20 mM CHAPS以25 μl/min的流速注射30 μl可以除去脂質(zhì)體和抗體。再生后,按照上述方法重復(fù)注射過(guò)程,可將脂質(zhì)體重新捕獲到NLC芯片表面。
10. HSV的抗體(10, 5, 2.5 nM)與嵌入到NLC芯片表面脂質(zhì)體中的HSV-M2多肽的相互作用。
結(jié)論
    ProteOn XPR36蛋白相互作用系統(tǒng)提供了操作簡(jiǎn)便、低成本的方法,便于研究膜-蛋白之間和膜蛋白-抗體之間的相互作用。
    這些相互作用能通過(guò)ProteOn 系統(tǒng)的6*6陣列采用高通量的方式進(jìn)行測(cè)定。
    源于 POPC 和 POPS 的單層小泡(SUV)能夠被反復(fù)地捕獲到修飾過(guò)的ProteOn GLC芯片上,Aβ 多肽和 α-synuclein 多肽的結(jié)合程度亦能測(cè)定。
    能測(cè)定Aβ 多肽與芯片上捕獲的POPC/POPS SUV 表面的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。
    含有HSV標(biāo)簽的 M2 多肽的脂質(zhì)體,不管是生物素化與否,都可以反復(fù)結(jié)合到ProteOn NLC芯片上,重復(fù)性很好。
    抗HSV標(biāo)簽的抗體和嵌入到脂質(zhì)體中的M2多肽的相互作用也能被檢測(cè)到。
    ProteOn XPR36蛋白相互作用陣列系統(tǒng)是個(gè)強(qiáng)大的工具,可以用于研究膜和膜相關(guān)蛋白、多肽、抗體的相互作用。
參考文獻(xiàn)
Smith DP et al. (2008). Formation of a high affinity lipid-binding intermediate during the early aggregation phase of alpha-synuclein. Biochemistry 47 (5), 1425–1434.
Tew DJ et al. (2008). Stabilization of neurotoxic soluble beta-sheet-rich conformations of the Alzheimer’s disease amyloid-beta peptide. Biophys J 94 (7), 2752–2766.

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