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恒遠生物帶大家認識HE染色的基本原理

點擊次數(shù):12243   發(fā)布時間:2023/10/24 15:22:16

上海恒遠生物來給大家介紹一種細胞實驗常用的染色方法,即蘇木精—伊紅染色法 (hematoxylin-eosin staining),簡稱HE染色法。

一、HE染色基本原理

(1)細胞核染色原理

    蘇木精為堿性天然染料,可使細胞核著色。細胞核內(nèi)染色質(zhì)的成分主要是DNA,在DNA的雙螺旋結構中,兩條核苷酸鏈上的磷酸基向外,使DNA雙螺旋的外側帶負電荷,呈酸性,很容易與帶正電荷的蘇木精堿性燃料以離子鍵或氫鍵結合而被染色。蘇木精在堿性溶液中呈藍色,所以細胞核被染成藍色。

(2)細胞漿染色原理

    細胞漿內(nèi)主要成分是蛋白質(zhì),為兩性化合物、細胞漿的染色與pH值有密切關系,當pH調(diào)到蛋白質(zhì)等電點4.7-5.0時,胞漿對外不顯電性,此時酸或堿性染料不易染色。當pH調(diào)到6.7-6.8時,大于蛋白質(zhì)的等電點pH值,表現(xiàn)酸性電離,而帶負電荷的陰離子,可被帶正電荷的染料染色,現(xiàn)時胞核也被染色,核和胞漿難以區(qū)分。因此必須把pH調(diào)至胞漿等電點以下,在染液中加入醋酸使胞漿帶正電荷(陽離子),就可被帶負電荷(陰離子)的染料染色。伊紅Y是一種化學合成的酸性染料,在水中離解成帶負電荷的陰離子,與蛋白質(zhì)的氨基正電荷(陽離子)結合而使細胞漿染色,細胞漿、紅細胞、肌肉、結締組織,嗜伊紅顆料等被感染成不同程度的紅色或粉紅色,與藍色的細胞核形成鮮明的對比。

(3)細胞HE染色流程

    培養(yǎng)的細胞HE染色過程與組織切片的染色過程基本相同,包括樣品制備、染細胞核、染細胞質(zhì)、脫水、透明、封固和觀察等步驟。

1.樣品制備

細胞:取細胞密度約為1×105/mL接種于含蓋玻片的培養(yǎng)瓶中,放入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間,待細胞基本長成單層,取出長有細胞的蓋玻片,用PBS洗3次。

2.染細胞核

①.固定

1)將蓋玻片浸入95%乙醇固定15min,PBS洗2次,每次1min;

2)浸入蘇木精染液,染色5-10min。

②.分色

1)自來水浸洗,浸入稀鹽酸乙醇溶液進行分色,數(shù)即可;

2)自來水浸洗,浸入淡氨水中,使胞核藍化3-5min;

3)自來水浸洗。

③.染細胞質(zhì)

1)浸入伊紅染液,染色5-10min;

2)自來水浸洗;

3.脫水

逐脫水:經(jīng)70%、80%、90%乙醇各脫水1次,95%乙醇脫水2次,百分百的乙醇脫水3次,每次1min。

4.透明

二甲苯透明3次,每次1min。

5.封固

在載玻片上滴加中性樹膠,將有細胞一面的蓋玻片向下封固于載玻片上。

6.觀察

光鏡下觀察,細胞質(zhì)呈粉紅色,細胞核呈藍紫色。

注意事項:

①.染色時調(diào)節(jié)pH值很重要。如果組織塊在福爾馬林中固定時間長,組織酸化而影響細胞核著色。因此要在自來水中沖洗時間長一些或在飽和碳酸鋰水溶液中處理10-30min,這樣可以使細胞核著色較深。染伊紅時胞漿著色不佳,可在伊紅溶液中滴加1-2滴冰醋酸。

②.切片染蘇木精后,分色這一步是關鍵,應在顯微鏡下控制進行,一般以細胞核染色清楚而細胞質(zhì)基本無色為佳。如果過分延長分色時間將導致染色太淺,應重新染色后再行分色。

③.切片經(jīng)酒精脫水后,入二甲苯時可出現(xiàn)白色不透明狀態(tài),此為脫水不che底,應將切片退回無水酒精,換酒精、二甲苯,以求che底脫水與透明。

④.在染色過程中不要讓切片干燥,以免切片收縮、變形,影響神經(jīng)元形態(tài)。

⑤.切片從二甲苯取出或進入二甲苯,切片周邊均應擦干凈或吸干多余水分。

⑥.zui后封固時,要用中性樹脂,防止日后褪色,蓋片要選大于組織塊的面積,如漏出一部分不久將會褪色,所用樹脂濃度要適當,樹脂封固時不能有氣泡。

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原創(chuàng)作者:上海恒遠生物科技有限公司

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