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恒遠(yuǎn)生物|免疫熒光技術(shù)的基本原理

點(diǎn)擊次數(shù):12272   發(fā)布時(shí)間:2023/10/17 13:29:15

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù),是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展zui早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合,利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。

該技術(shù)的主要特點(diǎn)是:特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。
主要缺點(diǎn)是:非特異性染色問題尚未完quan解決,結(jié)果判定的客觀性不足,技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。

一、原理

免疫學(xué)的基本反應(yīng)是抗原-抗體反應(yīng)。由于抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,所以當(dāng)抗原抗體發(fā)生反應(yīng)時(shí),只要知道其中的一個(gè)因素,就可以查出另一個(gè)因素。免疫熒光技術(shù)就是將不影響抗原抗體活性的熒光色素標(biāo)記在抗體(或抗原)上,與其相應(yīng)的抗原(或抗體)結(jié)合后,在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)一種特異性熒光反應(yīng)。

直接法:將標(biāo)記的特異性熒光抗體,直接加在抗原標(biāo)本上,經(jīng)一定的溫度和時(shí)間的染色,用水洗去未參加反應(yīng)的多余熒光抗體,室溫下干燥后封片、鏡檢。

間接法:如檢查未知抗原,先用已知未標(biāo)記的特異抗體(di一抗體)與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng),用水洗去未反應(yīng)的抗體,再用標(biāo)記的抗抗體(第二抗體)與抗原標(biāo)本反應(yīng),使之形成抗原—抗體—抗體復(fù)合物,再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體,干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體,則表明抗原標(biāo)本是已知的,待檢血清為di一抗體,其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體,同于血清球蛋白有種的特異性,如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng),因此,制備標(biāo)記抗體適用于雞任何抗原的診斷。

二、技術(shù)分類:

1.熒光抗體技術(shù)(熒光顯微鏡技術(shù))

抗原抗體反應(yīng)后,利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測方法。

2.免疫熒光測定技術(shù):

抗原抗體反應(yīng)后,利用特殊儀器測定熒光強(qiáng)度而推算被測物濃度的檢測方法。

1)熒光物質(zhì)

熒光色素

許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象,但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。

常用的熒光色素:

(1)異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末,易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4,zui大吸收光波長為490495nm,zui大發(fā)射光波長520530nm,呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光有兩種同分異結(jié)構(gòu),其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都geng好,在冷暗干燥處可保存多年,是應(yīng)用zui廣泛的熒光素。

其主要優(yōu)點(diǎn)是:

①人眼對(duì)黃綠色較為敏感

②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。

(2)四乙基羅丹明為橘紅色粉末,不溶于水,易溶于酒精和丙-酮。性質(zhì)穩(wěn)定,可chang期保存。zui大吸收光波長為570nm,zui大發(fā)射光波長為595-600nm,呈橘紅色熒光。

(3)四甲基異硫氰酸羅丹明,zui大吸引光波長為550nm,zui大發(fā)射光波長為620nm,呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明,可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧�。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結(jié)合,但熒光效率較低。

常見熒光素的特性:

1)FITC:黃色結(jié)晶粉末,吸收光:490~495nm,發(fā)射光:520~530nm,明亮的黃綠色熒光。

2)RB200: 橘紅色粉末, 吸收光570nm,發(fā)射光 595~600nm,橘紅色熒光。

3)TRITC: 紫紅色粉末,吸收550nm,發(fā)射光 620nm,橙紅色熒光。

4)鑭系:Eu3+、Tb3+

5)PE:吸收光490~560nm,發(fā)射光 595nm,紅色熒光。

6)其它:酶作用后產(chǎn)生熒光物質(zhì)。

原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司

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