細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融,實(shí)驗(yàn)證明這樣可以大限度的保存細(xì)胞活力。目細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑,這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性,加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法,這樣可以bao證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。
細(xì)胞復(fù)蘇是一個(gè)簡(jiǎn)單的試驗(yàn)操作,但操作中也有許多需要注意的事項(xiàng),在實(shí)驗(yàn)操作中注意細(xì)小的問(wèn)題,才能使復(fù)蘇后的細(xì)胞保持良好的狀態(tài),針對(duì)細(xì)胞復(fù)蘇應(yīng)該注意以下幾點(diǎn):
1. 可以提把需要的體積的培養(yǎng)液放到培養(yǎng)瓶里,擰松瓶蓋,放到孵箱里30分鐘--1個(gè)小時(shí);
2. 為防止凍存管在升溫時(shí)出現(xiàn)爆裂等情況,可以在放入水浴就把超凈臺(tái)里的蓋子擰松一下然后再擰上;
3. 水浴溫度37℃左右。
一、凍存和復(fù)蘇的原則:慢凍快融
當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下,可以產(chǎn)生以下變化:細(xì)胞器脫水,細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高,并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。
如果緩慢冷凍,可使細(xì)胞逐步脫水,細(xì)胞內(nèi)不會(huì)產(chǎn)生大的冰晶;如果快速冷凍的話,細(xì)胞內(nèi)就會(huì)產(chǎn)生大的冰晶,大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過(guò)程應(yīng)快融,目的是防止小冰晶形成大冰晶,即冰晶的重結(jié)晶。
二、慢凍程序
1. 標(biāo)準(zhǔn)程序:采用細(xì)胞凍存器
當(dāng)溫度在-25 ℃以上時(shí),1~2 ℃/min;
當(dāng)溫度達(dá)-25 ℃以下時(shí),5~10 ℃/min;
當(dāng)溫度達(dá)-100℃時(shí),可迅速放入液氮中。
2. 簡(jiǎn)易程序:將冷凍管(管口要朝上)放入紗布袋內(nèi),紗布袋系以線繩,通過(guò)線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口,按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度,在40 min內(nèi)降至液氮表面過(guò)夜,次日早晨投人液氮中。
3. 傳統(tǒng)程序:冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽cahng期儲(chǔ)存。
三、低溫保護(hù)劑的應(yīng)用
在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑,能大大提高凍存效果。
常用的低溫保護(hù)劑是DMSO,它是一種滲透性保護(hù)劑,可迅速透入細(xì)胞,提高胞膜對(duì)水的通透性,降低冰點(diǎn),延緩凍結(jié)過(guò)程,能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)透出細(xì)胞外,在胞外形成冰晶,減少胞內(nèi)冰晶,從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。
四、細(xì)胞凍存方法
1. 預(yù)先配制凍存液
(1)10%DMSO + 細(xì)胞生長(zhǎng)液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液)
(2)10%甘油+ 細(xì)胞生長(zhǎng)液(20%血清+基礎(chǔ)培養(yǎng)液)
2. 取對(duì)數(shù)生cahng期細(xì)胞,經(jīng)胰酶消化后,加入適量?jī)龃嬉海?用吸管吹打制成細(xì)胞懸液(1×106 ~ 5 ×106細(xì)胞/ml)。
3. 加入1 ml細(xì)胞于凍存管中,密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱(chēng)和冷凍日期。液氮chang期保存。
五、保存細(xì)胞的復(fù)蘇方法
1. 快速解凍
凍存細(xì)胞從液氮中取出后,立即放入37℃水浴中,輕輕搖動(dòng)冷凍管,使其在1 分鐘內(nèi)全部融化(不要超過(guò)3 分鐘)。
2. 解凍后的細(xì)胞可直接接種到生長(zhǎng)培養(yǎng)液的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中直接進(jìn)行培養(yǎng),24小時(shí)后再用新鮮培養(yǎng)液替換舊培養(yǎng)液,以去除DMSO。
3. 如果細(xì)胞對(duì)冷凍保護(hù)劑特別敏感
解凍后的細(xì)胞應(yīng)先通過(guò)離心去除冷凍保護(hù)劑,然后再接種到生長(zhǎng)培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中。
原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司