一、ELISA的原理
ELISA的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性,酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性,又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí),受檢標(biāo)本(測(cè)定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與液體中的其他物質(zhì)分開(kāi)。再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體,也通過(guò)反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時(shí)固相上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后,底物被酶催化成為有色產(chǎn)物,產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),故可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高,間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果,使測(cè)定方法達(dá)到很高的敏感度。
二、ELISA的類型
ELISA可用于測(cè)定抗原,也可用于測(cè)定抗體。在這種測(cè)定方法中有三個(gè)必要的試劑:(1)固相的抗原或抗體,即"免疫吸附劑"(immunosorbent);(2)酶標(biāo)記的抗原或抗體,稱為"結(jié)合物"(conjugate);(3)酶反應(yīng)的底物。根據(jù)試劑的來(lái)源和標(biāo)本的情況以及檢測(cè)的具體條件,可設(shè)計(jì)出各種不同類型的檢測(cè)方法。用于臨床檢驗(yàn)的ELISA主要有以下幾種類型:
①.雙抗體夾心法測(cè)抗原
雙抗體夾心法是檢測(cè)抗原常用的方法,操作步驟如下:
1)將特異性抗體與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗體。除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。
2)加待檢樣本,孵育反應(yīng)。樣本中的抗原與固相抗體結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。除去其他未結(jié)合物質(zhì)。
3)加酶標(biāo)抗體,孵育反應(yīng)。固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合。洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體。此時(shí)固相載體上帶有的酶量與樣本中受檢抗原的量相關(guān)。
4)加底物顯色。固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。通過(guò)比色,測(cè)知標(biāo)本中抗原的量。
②.雙抗原夾心法測(cè)抗體
反應(yīng)模式與雙抗體夾心法類似。用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物,以檢測(cè)相應(yīng)的抗體。與間接法測(cè)抗體的不同之處為以酶標(biāo)抗原代替酶標(biāo)抗抗體。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋,可直接用于測(cè)定,因此其敏感度相對(duì)高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBs的檢測(cè)常采用本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原的制備,應(yīng)根據(jù)抗原結(jié)構(gòu)的不同,尋找合適的標(biāo)記方法。
③.間接法測(cè)抗體
間接法是檢測(cè)抗體常用的方法。其原理為利用酶標(biāo)記的抗抗體(抗人免疫球蛋白抗體)以檢測(cè)與固相抗原結(jié)合的受檢抗體,故稱為間接法。操作步驟如下:
1)將特異性抗原與固相載體聯(lián)結(jié),形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。
2)加稀釋的受檢血清,保溫反應(yīng)。血清中的特異抗體與固相抗原結(jié)合,形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后,固相載體上只留下特異性抗體,血清中的其他成份在洗滌過(guò)程中被洗去。
3)加酶標(biāo)抗抗體�?捎妹笜�(biāo)抗人Ig以檢測(cè)總抗體,但一般多用酶標(biāo)抗人IgG檢測(cè)IgG抗體。固相免疫復(fù)合物中的抗體與酶標(biāo)抗體抗體結(jié)合,從而間接地標(biāo)記上酶。洗滌后,固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢抗體的量正相關(guān)。
4)加底物顯色。本法主要用于對(duì)病原體抗體的檢測(cè)而進(jìn)行傳染病的診斷。
④.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體
當(dāng)抗原材料中的干擾物質(zhì)不易除去,或不易得到足夠的純化抗原時(shí),可用此法檢測(cè)特異性抗體。其原理為標(biāo)本中的抗體和一定量的酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)與固相抗原結(jié)合。標(biāo)本中抗體量越多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗體愈少,因此陽(yáng)性反應(yīng)呈色淺于陰性反應(yīng)。如抗原為高純度的,可直接包被固相。如抗原中會(huì)有干擾物質(zhì),直接包被不易成功,可采用捕獲包被法,即先包被與固相抗原相應(yīng)的抗體,然后加入抗原,形成固相抗原。洗滌除去抗原中的雜質(zhì),然后再加標(biāo)本和酶標(biāo)抗體進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合反應(yīng)。競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗體有多種模式,可將標(biāo)本和酶標(biāo)抗體與固相抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,抗HBc ELISA一般采用此法。另一種模式為將標(biāo)本與抗原一起加入到固相抗體中進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合,洗滌后再加入酶標(biāo)抗體,與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)�?笻Be的檢測(cè)一般采用此方法。
⑤.競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)抗原
小分子抗原或半抗原因缺乏可作夾心法的兩個(gè)以上的位點(diǎn),因此不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測(cè)定,可以采用競(jìng)爭(zhēng)法模式。其原理是標(biāo)本中的抗原和一定量的酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多,結(jié)合在固相上的酶標(biāo)抗原愈少,顯色也愈淺。小分子激素、藥物等ELISA測(cè)定多用此法。
⑥.捕獲包被法測(cè)抗體
IgM抗體的檢測(cè)用于傳染病的早期診斷中。間接法ELISA一般僅適用于檢測(cè)總抗體或IgG抗體。如用抗原包被的間接法直接測(cè)定IgM抗體,因標(biāo)本中一般同時(shí)存在較高濃度的IgG抗體,后者將競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合固相抗原而使一部份IgM抗體不能結(jié)合到固相上。因此如用抗人IgM作為二抗,間接測(cè)定IgM抗體,必須先將標(biāo)本用A蛋白或抗IgG抗體處理,以除去IgG的干擾。在臨床檢驗(yàn)中測(cè)定抗體IgM時(shí)多采用捕獲包被法。先用抗人IgM抗體包被固相,以捕獲血清標(biāo)本中的IgM(其中包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM)。然后加入抗原,此抗原僅與特異性IgM相結(jié)合。繼而加酶標(biāo)記針對(duì)抗原的特異性抗體。再與底物作用,呈色即與標(biāo)本中的IgM成正相關(guān)。此法常用于病毒性感染的早期診斷。甲型肝炎病毒(HAV)抗體的檢測(cè)模式。類風(fēng)濕因子(RF)同樣能干擾捕獲包被法測(cè)定IgM抗體,導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。因此中和IgG的間接法近來(lái)頗受青睞,用這類試劑檢測(cè)抗CMV IgM和抗弓形蟲(chóng)IgM抗體已獲成功。
⑦.ABS-ELISA法
ABS為親和素(avidin)生物素(biotin)系統(tǒng)(system)的略語(yǔ)。親和素是一種糖蛋白,分子量60000,每個(gè)分子由4個(gè)能和生物素結(jié)合的亞基組成。生物素為小分子化合物,分子量244。用化學(xué)方法制成的衍生物素- 羥基琥珀酰亞胺酯可與蛋白質(zhì)和糖等多種類型的大小分子形成生物素標(biāo)記產(chǎn)物,標(biāo)記方法頗為簡(jiǎn)便。生物素與親和素的結(jié)合具有很強(qiáng)的特異性,其親和力較抗原抗體反應(yīng)大得多,兩者一經(jīng)結(jié)合就為穩(wěn)定。由于一個(gè)親和素可與 4個(gè)生物素分子結(jié)合,因此如把ABS與ELISA法可分為酶標(biāo)記親和素-生物素(LAB)法和橋聯(lián)親和素-生物素(ABC)法兩種類型。兩者均以生物素標(biāo)記的抗體(或抗原)代替原ELISA系統(tǒng)中的酶標(biāo)抗體(抗原)。在LAB 中,固相生物素先與不標(biāo)記的親和素反應(yīng),然后再加酶標(biāo)記的生物素以進(jìn)一步提高敏感度。在早期,親和素從蛋清中提取,這種卵親和素為堿性糖蛋白,與聚苯乙烯載體的吸附性很強(qiáng),用于ELISA中可使本底增高。從鏈霉菌中提取的鏈霉親和素則無(wú)此缺點(diǎn),在ELISA應(yīng)用中有替代者的趨勢(shì)。由于ABS-ELISA較普通ELISA多用了兩種試劑,增加了操作步驟,在臨床檢驗(yàn)中ABS-ELISA應(yīng)用不多。
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