1．石蠟切片脫蠟至水：（石蠟切片染色前應(yīng)置 60℃ 1 小時(shí)） 。

    ① 二甲苯 、II，各 10 分鐘。

    ② 梯度酒精：100%，2 分鐘 95%，2 分鐘 80%，2 分鐘 70% 2 分鐘。

    ③ 蒸餾水洗：5 分鐘，2 次（置于搖床）。

    2．過(guò)氧化氫封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶：3%H2 O2 ，室溫 10 分鐘（避光） 。

    3．蒸餾水洗：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

    4．抗原修復(fù)：根據(jù)待檢測(cè)的抗原，選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā?/p>

    附：抗原修復(fù)液（10mMpH 6.0 枸櫞酸鈉緩沖液）的配制：

    ① 儲(chǔ)備液的配制：A 液：枸櫞酸三鈉- 2H2O 29.41g + 蒸餾水 1000ml；B 液：枸櫞酸 21g + 蒸餾水 1000ml；

    ② 工作液的配制：A 液 82ml+ B 液 18ml+ 蒸餾水 900ml

    抗原修復(fù)的方法：

    ① 高壓鍋處理技術(shù)：枸櫞酸鈉緩沖液（10mM，PH6.0），淹沒(méi)切片，蓋上鍋蓋，高壓鍋內(nèi)煮沸，上汽 3 分鐘后緩慢冷卻（可用自來(lái)水在高 壓鍋外沖，以助冷卻） 。

    ② 微波處理技術(shù)：用塑料切片架，置于塑料或耐溫玻璃容器內(nèi)，枸櫞酸 鈉緩沖液淹沒(méi)切片，選擇中高或高檔,5 分鐘;取出并補(bǔ)充已預(yù)熱的 枸櫞酸鈉緩沖液； 再選擇中高或高檔，5分鐘（.*佳溫度為 92 95℃）

    ③ 酶消化處理。

    抗原修復(fù)的注意事項(xiàng)：

    ① 組織不能干。

    ② 選擇抗原修復(fù)方法要因抗體而異。

    ③ 該方法主要用于 10%福爾馬林固定、石蠟包埋組織。

    ④ 抗原修復(fù)后至 DAB 顯色的過(guò)程中，均需用 PBS 緩沖液。

    5．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

    6．正常血清封閉：從染片缸中取出切片，擦凈切片背面水分及切片正面組織周圍的水分 （保持組織呈濕潤(rùn)狀態(tài),）滴加正常山羊或兔血清 （與第二抗 體 同源動(dòng)物血清）處理，37℃，15 分鐘。

    附：正常血清配制 ( 或按試劑盒規(guī)定的濃度配制)：按 1:20比例，用 PBS 配制，每張切片需要量按 50μ+5μl (10%拋灑量) 計(jì)算。

    7．滴加抗體：用濾紙吸去血清，不洗，直接滴加抗體，37℃ 2 小時(shí)（也可置于 4℃冰箱過(guò)夜） 。

    8．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

    9．滴加生物素化的二抗，37℃，40 分鐘。

    10．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

    11．滴加三抗 （SAB 復(fù)合物） ，37℃，40 分鐘。

    12．PBS：5 分鐘，2 次（置于搖床） 。

    13．DAB 顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止（自來(lái)水沖終止） 。

    附：DAB 的配制① 儲(chǔ)備液(DAB 25mg/ml)的配制：DAB 250mg + PBS 10ml，待完全溶解后分裝成 1ml，100μl，50μl ，20μ l 等，-20℃，凍存。② 工作液：DAB 儲(chǔ)備液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

    14．自來(lái)水（細(xì)水）充分沖洗。

    15．蘇木素復(fù)染，室溫，30 秒，自來(lái)水沖洗。

    16．自來(lái)水沖洗返藍(lán)，15 分鐘。

    17．梯度酒精脫水：80%，2 分鐘 95%，2 分鐘 100%，2 次，5 分鐘。

    18．二甲苯透明：I ，II （二甲苯）各 5 分鐘。
   
    19．封片：加拿大樹膠（或中性樹膠）封片。

原創(chuàng)作者：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司