人體內(nèi)的細胞注定是要死亡的,有些死亡是生理性的,有些死亡則是病理性的,有關(guān)細胞死亡過程的研究,已成為生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的一個熱點,身為一位科研工作者,對細胞凋亡的幾種檢測方法都應(yīng)該有所了解!今天上海恒遠為大家整理了相關(guān)內(nèi)容,希望能夠幫到大家。
一、形態(tài)學(xué)觀察方法
1.HE染色、光鏡觀察:凋亡細胞呈圓形,胞核深染,胞質(zhì)濃縮,染色質(zhì)成團塊狀,細胞表面有“出芽”現(xiàn)象。
2.丫啶橙(AO)染色,熒光顯微鏡觀察:醫(yī)學(xué)教/育網(wǎng)搜集整理活細胞核呈黃綠色熒光,胞質(zhì)呈紅色熒光。凋亡細胞核染色質(zhì)呈黃綠色濃聚在核膜內(nèi)側(cè),可見細胞膜呈泡狀膨出及凋亡小體。
3.臺盼藍染色:如果細胞膜不完整、破裂,臺盼藍染料進入細胞,細胞變藍,即為壞死。如果細胞膜完整,細胞不為臺盼藍染色,則為正常細胞或凋亡細胞。此方法對反映細胞膜的完整性,區(qū)別壞死細胞有一定的幫助。
4.透射電鏡觀察:可見凋亡細胞表面微絨毛消失,核染色質(zhì)固縮、邊集,常呈新月形,核膜皺褶,胞質(zhì)緊實,細胞器集中,胞膜起泡或出“芽”及凋亡小體和凋亡小體被臨近巨噬細胞吞噬現(xiàn)象。
二、DNA凝膠電泳
1.檢測原理
細胞發(fā)生凋亡或壞死,其細胞DNA均發(fā)生斷裂,細胞內(nèi)小分子量DNA的片斷增加,高分子DNA減少,胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)DNA的片斷。但凋亡細胞DNA斷裂點均有規(guī)律的發(fā)生在核小體之間,出現(xiàn)180-200bpDNA的片斷,而壞死細胞的DNA斷裂點為無特征的雜亂片斷,利用此特征可以確定群體細胞的死亡,并可與壞死細胞區(qū)別。
2.結(jié)果判斷
正�;罴毎鸇NA 電泳出現(xiàn)階梯狀(LADDER)條帶;壞死細胞DNA電泳類似血抹片時的連續(xù)性條帶。
三、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)核小體測定
凋亡細胞的DNA斷裂使細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)核小體。核小體由組蛋白及其伴隨的DNA的片斷組成,可由ELISA法檢測。
1.檢測步驟
1.1.將凋亡細胞裂解后高速離心,其上清液中含有核小體;
1.2.在微定量板上吸附組蛋白體;
1.3.加上清夜使抗組蛋白
抗體與核小體上的組蛋白結(jié)合;
1.4.加辣過氧化物酶標(biāo)記的抗DNA抗體使之與核小體上的DNA結(jié)合;
1.5.加酶的底物,測光吸收制。
2、用途
該法敏感性高,可檢測5*100/ml凋亡細胞�?捎糜谌�、大鼠、小鼠的凋亡檢測。該法不需要特殊
儀器,適合基層工作,但是不能測定凋亡細胞發(fā)生的絕多對量。
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