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分離蛋白質(zhì)實(shí)驗(yàn)操作內(nèi)容

點(diǎn)擊次數(shù):13173   發(fā)布時(shí)間:2012/11/9 14:54:57

 (一)原理

凡鹽析所獲得的粗制蛋白質(zhì)(鹽析得到的IgG)中均含有硫酸銨等鹽類,這類將影響以后的純化,所以純化前均應(yīng)除去,此過(guò)程稱為“脫鹽”(desalthing)。脫鹽常用透析法和凝膠過(guò)濾法,這兩種方法各有利弊。前者的優(yōu)點(diǎn)是透析后析品終體積較小,但所需時(shí)間較長(zhǎng),且鹽不易除盡;凝膠過(guò)濾法則能將鹽除盡,所需時(shí)間也短,但其凝膠過(guò)濾后樣品體積較大。所以,要根據(jù)具體情況選擇使用。前實(shí)驗(yàn)中樣品體積較小,凝膠達(dá)濾后樣品體積不會(huì)太增加,所以選用凝膠過(guò)濾法。

(二)試劑與器材

(1)Sephadex G-25。

(2)0.0175mol/L,pH6.7磷酸鹽緩沖液。

(3)奈氏(Nessler)試劑:于500ml錐形瓶?jī)?nèi)加入碘化鉀150g,碘110g,汞150g及蒸餾水100ml。用力振蕩7~15min,至碘的棕色開(kāi)始轉(zhuǎn)變時(shí),混合液溫度升高,將此瓶浸于冷水內(nèi)繼續(xù)振蕩,直到棕色的碘轉(zhuǎn)變?yōu)閹ЬG色的碘化鉀汞液為止。將上清液傾入2000ml量筒內(nèi),加蒸餾水至2000ml,混勻備用。

(4)20%(W/V)磺基水楊酸溶液。

(5)1.5cm×20cm層析柱。

(6)黑、白比色磁盤。

(三)操作

(1)取層析柱1支(1.5cm×20cm),垂直固定在支架上,關(guān)閉下端出口。將已經(jīng)溶脹好的Sephadex G-25中的水傾倒出去,加入2倍體積的0.0175mol/L,pH6.7磷酸鹽緩沖液,并攪拌成懸浮液,然后灌注入柱,打開(kāi)柱的下端出口,繼續(xù)加入攪勻的Sephadex G-25,使凝膠自然沉降高度到17cm左右,關(guān)閉出口。待凝膠柱形成后,在洗脫瓶中加入0.0175mol/L,pH6.7磷酸鹽緩沖液以3倍柱體積的磷酸鹽緩沖流過(guò)凝膠柱,以平衡凝膠。

(2)凝膠平衡后,用皮頭滴管除去凝膠柱面的溶液,將鹽析所得全部IgG樣品加到凝膠柱表面,打開(kāi)柱下口,控制流速讓IgG樣品溶液慢慢浸入凝膠內(nèi)。凝膠柱面上加一層的0.0175mol/L,pH6.7磷酸鹽緩沖液,并用此緩沖液洗脫,控制流速為0.5ml/min左右。用試管收集洗脫液,每管10滴。

(3)在開(kāi)始收集洗脫液的同時(shí)檢查蛋白質(zhì)是否已開(kāi)始流出。為此,由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色磁盤中,加入1滴20%磺基水楊酸,若呈現(xiàn)白色絮狀沉淀即證明已有蛋白質(zhì)出現(xiàn),直到檢查不出白色沉淀時(shí),停止收集洗脫液。

(4)由經(jīng)檢查含有蛋白質(zhì)的每管中,取1滴溶液,放置在白色比色盤孔中,加入1滴奈氏試劑,若呈現(xiàn)棕黃色沉淀說(shuō)明它含有硫酸銨。合并檢查后不含硫酸銨的各管收集液,即為“脫鹽”后的IgG。

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