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點(diǎn)擊次數(shù):12602 發(fā)布時(shí)間:2022/9/13 15:07:08
一、怎么選擇合適的對(duì)照?
1)同型對(duì)照:使用同型抗體做平行實(shí)驗(yàn),主要目的是消除抗體與樣本的非特異性結(jié)合。
2)陰性細(xì)胞對(duì)照:使用已知的不表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞做平行實(shí)驗(yàn),主要目的是消除抗體的非特異性結(jié)合。
3)二抗對(duì)照:第二抗體多為熒光標(biāo)記的多抗,非特異性結(jié)合一般較高,可能造成基礎(chǔ)熒光值偏高,設(shè)立二抗對(duì)照平行實(shí)驗(yàn)的主要目的是消除二抗的非特異性熒光著色。
4)陽(yáng)性對(duì)照:一般會(huì)使用已知的高表達(dá)目標(biāo)抗原的細(xì)胞做平行實(shí)驗(yàn),主要目的是排除實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)方法、試劑、操作等實(shí)驗(yàn)的影響因素。
5)空白對(duì)照:不進(jìn)行任何標(biāo)記的細(xì)胞,主要目的是用于測(cè)定基礎(chǔ)熒光信號(hào)表達(dá)值。
二、收集的細(xì)胞通過(guò)流式儀檢測(cè)時(shí),一般多少的細(xì)胞量合適?
進(jìn)行流式檢測(cè)時(shí),至少需要記錄5000個(gè)活細(xì)胞,一般調(diào)整細(xì)胞密度至1*106/100ul進(jìn)行流式檢測(cè)。
三、FCM檢測(cè)過(guò)程中如何設(shè)門(mén)(gating)?
一般根據(jù)散射光進(jìn)行設(shè)門(mén),即我們通常所說(shuō)的散(forward scatter, FSC)和側(cè)散(side scatter, SSC)來(lái)設(shè)門(mén)。FSC的大小與細(xì)胞的直徑成正相關(guān),不同的細(xì)胞,細(xì)胞越大,其FSC越大;反之越小。SSC的大小與細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)的質(zhì)量成正相關(guān),不同的細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)顆粒結(jié)構(gòu)越復(fù)雜,質(zhì)量越大,其SSC越大;反之越小。
四、FCM檢測(cè)過(guò)程中如何調(diào)節(jié)補(bǔ)償?
在FCM檢測(cè)過(guò)程中,如果存在多色,則必須進(jìn)行熒光補(bǔ)償調(diào)節(jié)。調(diào)節(jié)補(bǔ)償先要知道雙陰性細(xì)胞的情況,其次,必須要用單陽(yáng)和雙陰性細(xì)胞。只有在有陰性細(xì)胞作為參照的情況下,才能既不會(huì)過(guò)多又不會(huì)過(guò)少地調(diào)節(jié)補(bǔ)償。
五、FCM檢測(cè)時(shí),每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)一定要相同嗎?
FCM檢測(cè)時(shí),若不進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)而憑感覺(jué)隨意進(jìn)行實(shí)驗(yàn)會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。當(dāng)細(xì)胞量多而抗體量不變或細(xì)胞量不變而抗體量減少,那么熒光抗體平均分布到每個(gè)陽(yáng)性細(xì)胞上的量就會(huì)相對(duì)減少。由此可見(jiàn),不同的細(xì)胞量會(huì)影響終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此,在準(zhǔn)備樣本時(shí),必須進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),使每個(gè)分組及每次實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞數(shù)保持一致。
六、FCM檢測(cè)時(shí),如果存在多色分析,應(yīng)該如何進(jìn)行配色呢?
在FCM檢測(cè)過(guò)程中,如果存在多色分析,雖然可以通過(guò)熒光補(bǔ)償來(lái)消除熒光光譜重疊的影響。但調(diào)節(jié)補(bǔ)償過(guò)大在一定程度上仍然會(huì)影響測(cè)值的準(zhǔn)確性,因此,我們一般建議盡量選擇熒光光譜重疊少的熒光抗體組合。
原創(chuàng)作者:上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司
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